1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050

急性腦血管病又稱腦卒中，其發(fā)病率逐年上升，已成為第一大致殘病因和第二大致死病因。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示[1]，我國每年新發(fā)腦卒中病例約有200萬，年腦卒中發(fā)病率約為(116～219) /10萬人口，年腦卒中死亡率約達(dá)到發(fā)病率的一半：( 58～142 ) /10萬人口。腦卒中又可分為缺血性腦卒中(ischemic Stroke, IS)和出血性腦卒中(Hemorrhagic Stroke )[2]，其中缺血性腦卒中占全部腦卒中發(fā)病率的80%左右，并且其發(fā)病率隨年齡的增長而增高。因此，了解缺血性腦卒中的發(fā)生發(fā)展和防止措施具有重要意義。本實驗使用線栓法阻斷大鼠大腦中動脈(Middle Celebral Artery,MCA)制作缺血性腦損傷的方法，制作成熟的大鼠缺血性腦損傷模型是該研究的基礎(chǔ)。然而，該模型的方法已有多種，在前人工作的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良和反復(fù)驗證，結(jié)合在其他實驗室的技術(shù)，現(xiàn)將本實驗的造模過程和結(jié)果報道如下。

1 儀器與材料

1.1 動物 SPF級SD雄性大鼠，60只，體重260～280 g。由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(甘)2015-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心SPF級實驗室，室溫(23±2)℃，濕度45%～55%，自由飲水處理原則。

1.2 材料 水合氯醛(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)；磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液(批號：1114A029，北京索萊寶科技有限公司)；魚線(愛魚者德國原絲魚線)；微型動脈夾(美萊醫(yī)療器械)；24孔板(海門市春博生物實驗器械廠)。

2 方法

2.1 造模與分組 將直徑0.235 mm的魚線用鋒利的手術(shù)刀片裁剪為長約3～4 cm/段，用酒精燈將魚線一端輕微燒一下(目的把魚線頭端燒圓滑，切記把魚線頭端燒成釘子帽狀。)之后用黑色Marker筆，用刻度尺比量，從魚線頭端開始計算，距離18～20 mm處對線栓做標(biāo)記。把制作好入選的線栓放入實驗盒子內(nèi)備用。按照3～5 mL/kg體重的量腹腔注射10%水合氯醛麻醉動物，待大鼠麻醉充分將大鼠平躺與手術(shù)操作臺上。術(shù)前常規(guī)消毒，在大鼠頸部正中處，從下頜下1.5～2 cm開始，做一大約長為3 cm左右的切口，之后小心剝離出大鼠的右側(cè)頸總動脈，頸外動脈，頸內(nèi)動脈三條動脈分叉處，將頸外動脈離心處永久性結(jié)扎，用微型血管夾夾住頸總動脈和頸內(nèi)動脈，在頸外動脈向心處打一活結(jié)，用于固定線栓，在頸外動脈活結(jié)和死結(jié)之間剪一小口，剪破血管時注意血管剪與血管之間呈45°角，剪口寬度不超過總血管的1/2。將準(zhǔn)備好的線栓從切口處插入頸外動脈向心端，到達(dá)頸總動脈與頸內(nèi)、外血管分叉處，繞過分叉處進(jìn)入頸內(nèi)動脈，此時剪斷頸外動脈死結(jié)的向心處，取開頸內(nèi)動脈的血管夾，調(diào)整線栓角度，順勢經(jīng)過頸內(nèi)動脈進(jìn)入大腦中動脈。在從頸總動脈分叉處記起，線栓大約進(jìn)入18～20 mm處時，線栓會受到輕微阻力，停止插線栓。扎緊在頸外動脈向心處活結(jié)。2 h后拔出線栓至頸總動脈分叉處。待大鼠清醒后行模型評分，將制作成功的模型按照隨機數(shù)字表分組，根據(jù) 1 d、3 d、7 d、14 d分為四組，每組各10只。其中未活到預(yù)計天數(shù)者，隨時補充，保證每組10只。假手術(shù)組在下頜處打開切口，之后小心剝離出大鼠的右側(cè)頸總動脈，頸外動脈，頸內(nèi)動脈三條動脈分叉處，不做任何處理，縫合切口。

2.2 觀察指標(biāo) 對各實驗組大鼠采用Bederson[3]等0～5分評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分。標(biāo)準(zhǔn)如下:0分-神經(jīng)功能完全正常，活動自如；1分-對側(cè)(左前肢)肌力下降，呈內(nèi)收屈曲狀；2分-對側(cè)(左側(cè))自主旋轉(zhuǎn)或劃圈，平地時；3分-對側(cè)(左側(cè))傾倒，平地時；4分-昏睡或者昏迷的意識障礙；5分-大鼠的死亡。其中1-3分為成功模型。

2.3 標(biāo)本采集 取成功MCAO模型根據(jù)1 d、3 d、7 d、14 d行缺血再灌。采用10%水合氯醛按照3～4 mL/kg的劑量對大鼠進(jìn)行腹腔注射麻醉。待麻醉成功后，使用實驗動物電動剃須刀將麻醉成功的大鼠胸腹部的毛發(fā)剪去，將大鼠仰臥于手術(shù)臺上，四肢固定，常規(guī)消毒鋪巾，按照無菌原則手術(shù)操作；沿前正中線剪開皮膚、鈍性分離皮下組織，組織剪從胸骨柄正中剪開，使用止血鉗夾閉出血動脈止血，充分暴露大鼠心臟、主動脈，從心尖處插入動靜脈留置針(針頭內(nèi)包含針芯)至主動脈根部，拔出針芯，連接輸液管，剪開右心耳，立即用含有肝素(10 μ/mL)的生理鹽水行心臟灌注，待大鼠肝臟組織顏色變淡，且從右心耳出口流出的灌注液由紅色逐漸變淡并呈完全清亮為止。將大鼠俯臥于手術(shù)臺上，固定大鼠頭部、四肢，常規(guī)消毒鋪巾，按照無菌原則手術(shù)操作，沿頭部背側(cè)中線剪開皮膚，分離皮下組織，剝離骨膜，止血鉗咬除大鼠頂部顱骨，小心分離取出大鼠腦組織，取出置于-80 ℃冰箱保存留用。

2.4 MCAO再灌注模型HE染色 石蠟切片二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水，蘇木素染色4 min，流水沖洗，1%的鹽酸酒精溶液分化5s，流水沖洗，伊紅染色2 min，水洗3次，梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。

2.5 MCAO再灌注模型TTC染色 ①TC染液的配置：用0.1 mol/LpH7.5的磷酸緩沖液配制成0.5%濃度的TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)，并調(diào)溶液的pH到6.8～7.2。②切片：將在-20 ℃的冰箱中保存的腦子取出，一般切成5～6片, 每隔2 mm 切一片。第1刀在腦前極與視交叉連線中點處；第2刀在視交叉部位；第3刀在漏斗柄部位；第四刀在漏斗柄與后葉尾極之間,總共切6片。③將切片置于TTC 中， 37 ℃的30 min，4%多聚甲醛固定12 h。之后將數(shù)據(jù)輸入Image Pro Plus5.0軟件進(jìn)行處理，確定缺血部位的梗死面積。

3 結(jié)果

3.1 大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果 采用Bederson等0-5分評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能評分。實驗點選取，2 h、1 d、3 d、7 d、14 d。實驗對象：每只成功模型大鼠。神經(jīng)功能評分隨著腦缺血再灌注的延長而慢慢恢復(fù)。結(jié)果是跟空白組比較，腦缺血再灌2h神經(jīng)功能評分3～4分(P<0.01)；1 d神經(jīng)功能評分3分(P<0.01)；3 d神經(jīng)功能評分2～3分(P﹤0.01)；7 d神經(jīng)功能評分1～2分(P<0.05)；14 d神經(jīng)功能評分0～1分(P>0.05)。結(jié)果如圖1所示。

3.2 MCAO模型再灌HE染色結(jié)果 空白對照組和假手術(shù)組HE染色切片呈紅色，缺血損傷再灌注組正常組織HE染色呈紅色，梗死灶呈白色，兩者界限明顯。正常組的細(xì)胞排列整齊，腦白質(zhì)組織結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核飽滿無固縮，假手術(shù)組與之相比較無明顯變化。M1組染色逐漸變淺，腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，細(xì)胞核固縮并且細(xì)胞排列紊亂，隨時間增加表現(xiàn)明顯。M7組后染色相對清晰，腦白質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸正常，細(xì)胞核固縮現(xiàn)象明顯減輕，細(xì)胞排列逐漸整齊。M14基本恢復(fù)正常。如圖2所示。

3.3 MCAO模型再灌TTC染色結(jié)果 成功的腦缺血再灌注模型因大腦中動脈阻塞缺血而導(dǎo)致腦組織壞死，壞死的腦組織不能被TTC染色而呈現(xiàn)蒼白色，未缺血的部分被TTC染成紅褐色。如圖3所示。與正常組相比較，模型14 d組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P﹥0.05)，隨著時間增加，梗死面積逐漸增大，模型1 d，3 d差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.01)，7 d梗死面積差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P﹤0.05)。7 d后梗死面積逐漸縮小。見表1。

表1 各組梗死面積均值

組別梗死面積空白組假手術(shù)組模型1d000.36±0.03**模型3d0.48±0.05**模型7d0.50±0.08*模型14d0.18±0.02

注：與正常組比較,*P﹤0.05,**P﹤0.01。

4 討論

缺血性腦損傷發(fā)病率的逐年上升，引起了國內(nèi)外學(xué)者對其發(fā)病機制和治療方法的高度重視，作為該病研究的基礎(chǔ)，用線栓法制作成功的缺血性腦損傷模型具重要作用。應(yīng)用線栓法阻斷大鼠大腦中動脈造成缺血性腦損傷模型方法有多種，其后手術(shù)方法也有多種改進(jìn)，目的是為了手術(shù)創(chuàng)傷更小，操作更簡單，成功率高，死亡率低。之前最常用的造模方法是從頸總動脈剪一“V”字行切口[4]，從頸總動脈插入進(jìn)入大鼠大腦中動脈。該方法雖然不用分離頸內(nèi)動脈，在血管機械刺激方面較小[5]，但是該方法很難從頸總動脈進(jìn)入大鼠大腦中動脈，線栓大約進(jìn)入10 mm處就不能進(jìn)入，期間調(diào)整角度，反復(fù)插入，反而加重?fù)p傷，增加死亡率。

實驗結(jié)果顯示：從頸外動脈插入繞過分叉路口進(jìn)入頸內(nèi)動脈時更易進(jìn)入大鼠大腦中動脈，解決了很多學(xué)者用之前的方法很難進(jìn)入大鼠大腦中動脈而導(dǎo)致模型評分低和死亡率高的缺點。并且造模時間更短，效率更高，成功率高，完成一只動物造模僅用10～15 min,死亡率低至10%以下。本實驗同時表明，造模2 h后拔出魚線，隨時間增加梗死面積逐漸增大，但到7 d后，梗死面積逐漸減小，到14 d時神經(jīng)功能得到改善，故而說明，在發(fā)生缺血性腦損傷的同時，內(nèi)源性的代償機制也被觸發(fā)，此過程可見血管生成。本實驗結(jié)果為后續(xù)缺血性腦損傷機制和治療方面的研究提供基礎(chǔ)和思路。

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