袁超

乳腺癌是女性最為常見的惡性腫瘤之一，目前據(jù)全球女性惡性腫瘤發(fā)病率首位，我國每年因乳腺癌死亡的病患超過7萬例。近年來，乳腺癌不僅發(fā)病率呈逐年上升趨勢，而且發(fā)病人群越來越年輕化［1］。由于乳腺癌發(fā)病機制尚不明確，所以早期診斷和治療是影響乳腺癌患者生存的關鍵，但目前常用的乳腺癌血清標志物如CA153、CA125和CEA診斷的敏感度和特異度均較低［2-3］。

microRNA是一類在真核細胞中發(fā)現(xiàn)的、由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過對其靶基因轉錄的調控參與真核細胞的分化、增殖、生長和凋亡的調節(jié)。目前隨著對miRNA研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)其不僅可以作為多種疾病治療的靶點［4-5］，而且在癌癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用［6-8］。研究發(fā)現(xiàn)［9-10］，由于受到內源性RNA酶的保護作用，來源于腫瘤組織的miRNA可以穩(wěn)定地存在于血液中，這種miRNA對腫瘤具體較高的特異性，且與癌癥的臨床分期、癌細胞轉移、術后復發(fā)以及無瘤生存期等有關。本研究通過對比乳腺癌患者、乳腺良性病變患者和健康人群血清miR-6861-5p的表達，分析血清miR-6861-5p與乳腺癌患者臨床病理特征、診斷以及預后的關系，探討血清miR-6861-5p檢測對乳腺癌患者的臨床診斷價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2013年1月至2015年6月山東省德州市第二人民醫(yī)院112例乳腺癌患者外周血（乳腺癌組），并經病理證實，同時隨機選取同時期乳腺良性病變女性患者外周血37例（良性病變組）（乳腺增生18例、乳腺囊腫12例以及乳腺纖維瘤7例），健康體檢女性外周血53例（健康組）。

納入標準：1）所有研究對象年齡、性別以及體重等一般資料完整；2）健康組和良性病變組患者未合并其他惡性腫瘤；3）乳腺癌患者收集外周血前未經任何放化療或者手術根除治療；4）年齡＞18周歲，且對本次研究知情并簽訂知情確認書，并經山東省德州市第二人民醫(yī)院倫理協(xié)會審查通過。排除標準：1）乳腺癌術后病理分期、分子分型不明確；2）合并胰腺癌、結腸癌等消化系統(tǒng)或其他惡性腫瘤的乳腺癌患者；3）健康研究對象納入前一年內有手術治療病史或有既往腫瘤病史，采血前3個月內有藥物服用史或住院治療病史；4）乳腺癌和乳腺良性病變患者在采集外周血前1周內有藥物服用史。

1.2 方法

1.2.1 血清miR-6861-5p的提取與檢測 采集研究對象外周血5～10 mL，EDTA抗凝，離心（1000×g）10 min（5810R，德國Eppendorf AG公司）收集血清。向200 μL血清中加入1 000 μL QIAzol溶解試劑（QI?GEN公司，德國），室溫靜置15 min，根據(jù)miRNeasy血清/血漿總RNA提取試劑盒（QIGEN公司，德國）說明書提取血清總RNA，DEPC水溶解總RNA。通過One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit（Takara，日本）將RNA逆轉錄為cDNA，PCR參數(shù)設置：37℃60 min，85℃ 5s。

RT-qPCR：根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM II（TakaRa公司，日本）說明書制備20 μL RT-qPCR反應體系，并使用ABI 7500熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）進行PCR擴增。PCR引物：mi-6861-5p上游引物：5'-ACACTCCAGCTGGGACTGGGTAGGTGGG C-3'，下游引物：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'；U6上游引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR參數(shù)設置：95℃，30 s，40個循環(huán)（90℃，5 s，65℃，30 s）。選擇U6作為內參照，并用2-Δt法（Δt=CTmiRNA-CTU6）計算miR-6861-5p的相對表達量。

1.2.2 乳腺癌患者血清學指標的檢測 收集血清，通過自動生化分析儀（AU680，Beckman Coulter公司，美國）檢測血清總膽固醇（total cholesterol，TC），甘油三酯（triglycerdes，TG），高密度膽固醇（high-density cholesterol，HDL-C）以及低密度膽固醇（low-density cholesterol，LDL-C）。

1.2.3 免疫組織化學檢測 收集根治性手術切除的乳腺癌組織，經石蠟包埋后制成4 μm的組織切片，根據(jù)購買的免疫組織化學試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司）說明書進行HER-2、孕激素受體（pro?gesterone receptor，PR）和雌激素受體（estrogen recep?tor，ER）的免疫組織化學檢測，以PBS代替一抗作為陰性對照。每張切片選取5個視野，請兩位副主任醫(yī)師以上的病理學專家在200×高倍鏡下進行盲法讀片，以陽性細胞所占總細胞比例作為陽性細胞比例。PR和ER定位于細胞核，而HER-2則定位于細胞膜，以陽性細胞比例≥10%為陽性，＜10%為陰性。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計學分析，t檢驗比較組間或組內差異；χ2檢驗比較組間差異。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-6861-5p在不同患者血清中的表達

3組研究對象在年齡、BMI、TC、TG、HDL-C以及LDL-C等一般臨床資料或指標上對比無顯著性差異（均P＞0.05，表1）；112例乳腺癌組患者血清miR-6861-5p相對表達量為（7.99±1.63），顯著高于良性病變組患者血清（6.45±1.06）（P＜0.05）和健康血清miR-6861-5p相對表達量（6.43±1.28）（P＜0.05），但miR-6861-5p在良性病變研究對象和健康研究對象血清中的相對表達量對比無顯著性差異（P＞0.05，圖1）。

2.2 血清miR-6861-5p表達與乳腺癌臨床病理特征的關系

以血清miR-6861-5p相對表達量＞8為高表達，≤8為低表達：112例乳腺癌患者血清miR-6861-5p低表達患者40例，高表達患者72例；miR-6861-5p在乳腺癌患者血清中表達與年齡、腫瘤直徑無關（P＞0.05），與淋巴結轉移、ER、PR和HER-2表達、TNM分期、分子分型以及組織學分期顯著相關（均P＜0.05，表2）。

2.3 血清miR-6861-5p在乳腺癌腫瘤切除前后的變化

112例乳腺癌患者均經手術切除腫瘤組織進行治療。對比手術前后血清miR-6861-5p相對表達量發(fā)現(xiàn)，111例乳腺癌患者術后血清miR-6861-5p表達下降，1例表達上升；術后112例乳腺癌患者miR-6861-5p相對表達量平均值為（6.76±1.60），顯著低于術前水平（P＜0.05，圖2）。

2.4 血清miR-6861-5p對乳腺癌臨床診斷的價值

miR-6861-5p診斷乳腺癌ROC曲線下面積（AUC）為0.781，當血清miR-6861-5p相對表達量為7.75時，約登指數(shù)取最大值，此時miR-6861-5p診斷乳腺癌敏感度為69.6%，特異度為77.8%（圖3）。

2.5 miR-6861-5p與乳腺癌術后復發(fā)的關系

所有患者術后均進行為期2年的隨訪，記錄患者術后乳腺癌腫瘤復發(fā)情況發(fā)現(xiàn)，血清miR-6861-5p低表達的乳腺癌患者術后1年、2年復發(fā)率分別為10.0%和22.5%，均顯著低于血清miR-6861-5p高表達乳腺癌患者（22.2%和38.9%，P＜0.05，圖4）。

表1 3組研究對象一般資料比較 例

圖1 miR-6861-5p在不同研究對象血清中的表達

表2 血清miR-6861-5p表達與乳腺癌臨床病理資料的關系例（%）

圖2 乳腺癌腫瘤切除前后血清miR-6861-5p變化

圖3 ROC曲線分析血清miR-6861-5p對乳腺癌臨床診斷價值

圖4 miR-6861-5p與乳腺癌術后復發(fā)的關系

3 討論

在血清/血漿中穩(wěn)定的microRNA被認為是最具潛力的腫瘤生物標志物，在乳腺癌的研究中，多種miRNA被證實可以用于乳腺癌的臨床診斷［11-14］。同時，典輝等［15］研究指出miR-127-3p在乳腺癌患者外周血中表達上調，并且其在乳腺癌患者血漿中的表達與乳腺癌腫瘤標志物CA153表達呈正相關，是一個乳腺癌潛在的腫瘤標志物。鐘婧等［16］研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在乳腺癌患者血清中不僅表達上調，而且與乳腺癌患者TNM分期和癌細胞轉移等有關，診斷乳腺癌的敏感性高達80%，特異度70%。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-6861-5p在乳腺癌患者血清中的表達量顯著高于健康女性和乳腺良性病變女性患者（P＜0.05），并且健康女性和乳腺良性病變女性患者血清 miR-6861-5p表達無顯著性差異（P＞0.05）。miR-6861-5p定位于人類染色體12q24.13，目前鮮見研究報道m(xù)iR-6861-5p的功能，僅Shimomura等［17］在日本人群中篩查可用于乳腺癌早期診斷microRNA組合時發(fā)現(xiàn)，miR-6861-5p在乳腺癌患者血清中的表達顯著高于健康女性，并且與血清miR-1246、miR-1307-3p、miR-6875-5p、miR4634聯(lián)合診斷乳腺癌的敏感度和特異度分別高達97.3%和82.9%。而本研究miR-6861-5p單獨診斷乳腺癌敏感度為69.6%，特異度為77.8%，由此提示血清miR-6861-5p檢測對乳腺癌篩查具有一定的臨床價值。

淋巴結轉移、TNM分期和組織學分期均可描述乳腺癌嚴重程度和受累范圍。本研究發(fā)現(xiàn)，淋巴結轉移乳腺癌患者血清miR6861-5p高表達比例高達80.4%（37/46），而淋巴結未轉移比例僅為53.0%（35/66）。有研究指出［18］，由于乳腺并不是人體維持生活活動所必須的器官，所以原位乳腺癌的及時發(fā)現(xiàn)與治療可以取得較好的臨床療效，并不危及患者的生命安全；但是與其他癌細胞一樣，乳腺癌細胞也失去了正常細胞的生物學特性，細胞之間的黏連能力較低，容易出現(xiàn)脫落。一旦乳腺癌細胞出現(xiàn)脫落，游離的癌細胞可經血液或淋巴液播散全身，形成轉移，危及患者生命，降低生存率。同時，血清miR-6861-5p高表達患者比例隨臨床分期升高而升高。左婷婷等［18］研究發(fā)現(xiàn)，Ⅰ期乳腺癌5年生存率高達90%，但Ⅲ～Ⅳ期乳腺癌卻低于70%；乳腺癌患者5年生存率隨臨床分期升高而降低。

根據(jù)乳腺癌腫瘤組織ER、PR和HER-2的表達可將乳腺癌分為Luminia A型、Luminia B型、HER-2過表達型和Basal-like型。乳腺癌分子分型不僅可以指導乳腺癌患者的臨床治療，而且與患者臨床治療效果和預后有關，HER-2（+）過表達型和Basal-like型乳腺癌預后最差，Luminia B型次之，Luminia A型乳腺癌預后最好［19-20］。本研究中miR-6861-5p在乳腺癌患者血清中的表達與乳腺癌腫瘤組織ER、PR、HER-2表達以及乳腺癌分子分型有關，并且手術切除乳腺腫瘤組織miR-6861-5p表達會顯著下調，低表達miR-6861患者術后腫瘤復發(fā)率較低，這提示檢測乳腺癌患者血清miR-6861-5p對乳腺癌患者臨床治療和預后預測具有一定的指導意義。

綜上所述，miR-6861-5p在乳腺癌患者血清中表達上調，是術前乳腺癌診斷、腫瘤分期、癌細胞轉移和術后監(jiān)測乳腺癌復發(fā)的潛在生物標志物。

[1]Chen W,Zheng R,Baade PD,et al.Cancer statistics in China,2015[J].Ca A Cancer J Clin,2016,66(2):115‐132.

[2]易琳,劉興明,林丁,等.血清CA153、CA125、CEA聯(lián)合檢測在乳腺癌診斷中的價值[J].重慶醫(yī)科大學學報,2012,37(9):802‐805.

[3]Xia J,Shi J,Wang P,et al.Tumour‐Associated autoantibodies as di‐agnostic biomarkers for breast cancer:A systematic review and me‐ta‐analysis[J].Scand J Immunol,2016,83(6):393‐408.

[4]張帆,崔慶華.microRNA與人類疾病關系研究中的生物信息學方法和資源[J].生理科學進展,2016,47(3):203‐209.

[5]Kang L,Yang C,Song Y,et al.MicroRNA‐23a‐3p promotes the devel‐opment of osteoarthritis by directly targeting SMAD3 in chondro‐cytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2016,478(1):467‐473.

[6]劉寧,徐波,梁寒,等.miRNA和惡性腫瘤研究進展[J].中國腫瘤臨床,2010,37(7):416‐420.

[7]Li W,Liu C,Zhao C,et al.Downregulation of β3 integrin by miR‐30a‐5p modulates cell adhesion and invasion by interrupting Erk/Ets 1 network in triple‐negative breast cancer[J].Int J Oncol,2016,48(3):151‐159.

[8]Li W F,Dai H,Ou Q,et al.Overexpression of microRNA‐30a‐5p in‐hibits liver cancer cell proliferation and induces apoptosis by target‐ing MTDH/PTEN/AKT pathway.[J].Tumor Biology,2016,37(5):5885‐5895.

[9]張慶勇,李乾元,羅春華.腫瘤標志物外周血microRNA的研究進展[J].細胞與分子免疫學雜志,2015,31(3):419‐421.

[10]Mitchell PS,Parkin RK,Kroh EM,et al.Circulating microRNAs as sta‐ble blood‐based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2008,105(30):10513.

[11]Cuk K,Zucknick M,Heil J,et al.Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.Int J Cancer,2013,132(7):1602‐1612.

[12]Shen J,Hu Q,Schrauder M,et al.Circulating miR‐148b and miR‐133a as biomarkers for breast cancer detection[J].Oncotarget,2014,5(14):5284‐5294.

[13]魏倩,張鵬.乳腺癌患者癌組織、血清miR‐17‐5p水平變化及意義[J].山東醫(yī)藥,2015,55(16):54‐55.

[14]Sochor M,Basova P,Pesta M,et al.Oncogenic MicroRNAs:miR‐155,miR‐19a,miR‐181b,and miR‐24 enable monitoring of early breast cancer in serum[J].BMC Cancer,2014,14(1):448.

[15]典輝,庫無非,何明長.miR‐127‐3P在乳腺癌患者中的表達及意義[J].腫瘤學雜志,2017,23(7):639‐642.

[16]鐘婧,周偉民,馬志紅,等.微小RNA‐21在乳腺癌患者血清中的表達及其與臨床病理特征的關系[J].中華實驗外科雜志,2015,32(1):157‐159.

[17]Shimomura A,Shiino S,Kawauchi J,et al.Novel combination of se‐rum microRNA for detecting breast cancer in the early stage[J].Cancer Sci,2016,107(3):326‐334.

[18]左婷婷,陳萬青.中國乳腺癌全人群生存率分析研究進展[J].中國腫瘤臨床,2016,43(14):639‐642.

[19]趙毅,鄧鑫.乳腺癌分子分型與治療策略[J].中國實用外科雜志,2015,35(7):704‐708.

[20]李雙,范紅敏,肖菲菲,等.不同分子分型及臨床病理特征與乳腺癌術后患者預后的關系[J].臨床與實驗病理學雜志,2016,32(1):39‐44.