翁元峰，楊志彪

（1.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2.中國科學(xué)院 上海巴斯德研究所，上海 200031）

Rap1是一種小GTPase蛋白，與Ras蛋白具有高度同源性，在決定下游信號通路及受體的結(jié)構(gòu)域上具有顯著的相似性[1]。

作為一類小G蛋白，Rap1可以被一系列的細胞外刺激因子所激活，包括生長因子、受體酪氨酸激酶、各類G蛋白等[2]。但是，由Rap1組成的信號通路主要是受GEFs和GAPs的嚴密調(diào)控，它們調(diào)控這些GTPases蛋白主要是通過控制其在與GTP結(jié)合的活性狀態(tài)和與GDP結(jié)合的失活狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)變。GEFs會通過促進結(jié)合的GDP釋放，再與GTP結(jié)合而激活GTPases。GAPs則可增強內(nèi)在的GTPase活性，使GTP水解[2]。

1 Rap1的生物學(xué)功能

1.1 細胞增殖中的Rap1信號通路

提到對Rap1功能的探究，首先會提到Ras-ERK信號通路。有實驗發(fā)現(xiàn)了一種Rap1的活性形式—RapV12，可能會通過競爭性抑制c-Raf1被Ras的活化[3]。同時，Rap1被報道稱在另一種成纖維細胞系中可以加速細胞的生長，并且在特定細胞系中具有激活B-Raf而不依賴于Ras的能力[4]。Rap1對于c-Raf1和B-Raf的活化效應(yīng)上的差異說明，Rap1GTP與c-Raf1的半胱氨酸富集區(qū)的結(jié)合能力要比B-Raf強。在免疫系統(tǒng)中，未通過特異性抗原刺激增殖的無性系T細胞會顯示出異常高的Rap1GTP水平，并且在正常T細胞克隆中，RapV12的過高表達會誘導(dǎo)一種ERK的活化以應(yīng)對抗原刺激的狀態(tài)[5]。目前，RapV12已經(jīng)被廣泛認為是Rap1的一種持續(xù)活性形式，并且最近的研究揭示了RapV12也是最不易受Rap1GAP的影響的一種形式[6]。在SPA-1（一種GAP）基因轉(zhuǎn)染的小鼠實驗中，Ishida等人發(fā)現(xiàn)內(nèi)生的Rap1會促進造血干細胞的增殖以及ERK的激活，這說明Rap1GTP誘導(dǎo)ERK的活化可能是通過B-Raf而不是Ras。相反，在SPA-1基因敲除后的小鼠T細胞中抗原刺激下持續(xù)激活的Rap1最終會導(dǎo)致T細胞的無能，這是因為缺失了Ras介導(dǎo)的ERK的活化。同時，這些結(jié)果也證實了關(guān)于Rap1信號通路在細胞增殖中的作用是高度依賴于細胞環(huán)境的這一猜想。

1.2 Rap1在細胞黏附與細胞連接中的作用

1.2.1 Rap1調(diào)控整合素的信號通路

雖然Rap1信號通路的多種功能都已被發(fā)現(xiàn)，但最被認可的是它參與整合素介導(dǎo)的細胞黏附過程。整合素是異二聚體形式的細胞內(nèi)的黏附分子（ICAMs），由一條不同的α鏈和β鏈組成。研究發(fā)現(xiàn)，粒細胞集落刺激因子誘導(dǎo)的細胞黏附可以通過轉(zhuǎn)染Spa1基因而被抑制[7]。后來又有三項獨立的實驗證實Rap1在整合素的信號通路中發(fā)揮作用。其中Katagiri等人發(fā)現(xiàn)在白血病細胞中，Rap1的表達會誘導(dǎo)由整合素αLβ2（LFA1）介導(dǎo)的細胞黏附[8]。

1.2.2 Rap1調(diào)控細胞之間的連接形式

對細胞的黏附與連接的調(diào)控主要體現(xiàn)在兩個水平：（1）嚴密地控調(diào)是在E-鈣黏蛋白的囊泡分選，這決定了它在細胞表面的水平；（2）信號級聯(lián)反應(yīng)控制細胞支架與E-鈣黏蛋白的連接，從而可以穩(wěn)定這種連接[9-10]。然而Rap1A和Rap1B似乎可以對兩種方式都產(chǎn)生影響。

首次發(fā)現(xiàn)Rap1參與細胞連接的調(diào)控是在果蠅的基因研究中，Rap1基因突變的細胞會有一個不同的形狀，并且會分散到周圍正常組織中，這說明這些突變的細胞存在一個細胞連接上的缺陷[11]。事實上，果蠅中的E-鈣黏蛋白（DE-鈣黏蛋白）是會平均分布在野生型（WT）細胞的外側(cè)，但在Rap1突變的細胞中這種分布是不一致的：DE-鈣黏蛋白會呈簇狀分布且集中在細胞的一側(cè)。這些蛋白簇還包含其他的連接蛋白：α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白以及ZO-1等。更重要的是，細胞頂側(cè)-基底側(cè)的極性以及α-連環(huán)蛋白、β-連環(huán)蛋白和DE-鈣黏蛋白的分布在Rap1變異細胞中并沒有受到影響。

Rap1在哺乳動物中對細胞連接的調(diào)控作用是通過發(fā)現(xiàn)DOCK4是一種非典型的GEF而確定的。這種蛋白是在篩查小鼠腫瘤抑制基因時發(fā)現(xiàn)的，而且此種蛋白的失活形式也在人類腫瘤細胞系中發(fā)現(xiàn)了[12]。研究證實，在缺乏DOCK4的骨肉瘤細胞系中細胞之間的連接會消失，但在轉(zhuǎn)入了WT DOCK4或者活性形式的Rap1后，細胞之間的連接卻很容易形成。

1.3 Rap1在惡性腫瘤中的作用

最初盡管有研究者關(guān)注了Rap1在惡性腫瘤發(fā)展過程中的可能發(fā)揮的潛在作用，但是直到近些年才開始有研究證明Rap1確實通過不同的信號通路在各類癌癥中發(fā)揮作用。Jun Xiang等[13]人進一步證實了在前列腺癌中，miR203會通過下調(diào)Rap1的表達從而抑制細胞增殖、黏附和侵襲。在卵巢癌中，有研究證實Rap1A可以通過ERK/p38以及Notch信號通路促進癌癥的轉(zhuǎn)移[14]。在乳腺癌中，最新研究證明miR-433可通過MAPK-Rap1A通路抑制癌細胞的生長[15]。綜上所述，盡管在不同實驗中驗證了Rap1通過不同的信號通路在癌癥中發(fā)揮作用，但可得出結(jié)論是Rap1在癌癥中發(fā)揮了促癌的作用。

2 調(diào)控Rap1的信號通路

2.1 Rap1 GEFs

有一部分GEFs的蛋白活性中心的結(jié)構(gòu)是相同的，它們有著獨特的受體或者第二信使。C3G是第一種被分離出來的Rap1 GEF，可以結(jié)合Crk受體蛋白上的SH3結(jié)構(gòu)域，進而磷酸化并激活[16]。Epac家族蛋白可以結(jié)合AMP并通過構(gòu)型的改變激活其GEF的活性。最近，有報道稱c-AMP類似物可以選擇性抑制由c-AMP介導(dǎo)的Epac的活化而不影響PKA活性。

2.2 Rap1 GAPs

相較于前面提到GEFs的分子多樣性，Rap1特異性的GAPs中只有兩類有著共同的蛋白活性中心——GAP相關(guān)結(jié)構(gòu)域（GRD）：rap GAPs以及SPA-1家族蛋白。有著GRD的蛋白質(zhì)在線蟲，果蠅到哺乳動物中都是高度保守的[17]。rap GAP-Ⅰ是第一種被分離出來的GAP，rap GAP-Ⅱ的N-末端可以結(jié)合Gal并且可以通過G蛋白結(jié)合受體移位到細胞膜。SPA-1被分離出來的原型是一種在淋巴造血細胞中由促有絲分裂刺激誘導(dǎo)而來的蛋白[18]。因此，每一種GAP似乎在不同的組織細胞中都展現(xiàn)了一種獨一無二的表達和亞細胞定位。

3 結(jié)論

目前，越來越多的研究揭示了Rap1在細胞增殖、黏附與細胞的連接，甚至在癌癥中的生物學(xué)功能，但其中不同的信號通路及復(fù)雜的作用機制仍然沒有清楚的認識。而對于GEFs和GAPs的分析則為Rap1在細胞中的活性，分布及穩(wěn)定的調(diào)控機制的探究提供了依據(jù)。Rap1在生理和病理過程中的信號通路的作用依賴于不同組織的細胞類型，而其中的分子機制應(yīng)當(dāng)有希望為控制人類疾病提供新的線索。