徐廣志

（安徽省阜陽市第三中學，安徽阜陽 236000）

高中生物中的DNA連接酶首次出現是在必修二第六章第二節(jié)“基因工程及其應用”中，其中介紹“脫氧核糖和磷酸交替連接而構成的DNA骨架上的缺口，需要靠DNA連接酶來‘縫合’”，從簡單的介紹中可以知道，DNA連接酶的作用是連接磷酸二酯鍵。再次出現時，是在生物選修三專題一“DNA重組技術的基本工具”中，這里介紹更為詳細，“DNA連接酶—‘分子縫合針’，將切下來的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA連接酶來完成的。1967年，世界上幾個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現了一種能夠將兩條DNA鏈連接起來的酶，稱之為DNA連接酶（DNA ligase）。根據酶的來源不同，可以將這些酶分為兩類：一類是從大腸桿菌中分離得到的，稱為E.coil DNA連接酶；另一類是從T4噬菌體中分離出來的，稱為T4DNA連接酶?！盵1]課本中介紹了DNA連接酶的發(fā)現時間、酶的來源及不同DNA連接酶所起的作用，并提出“連接平末端之間的效率比較低”。雖然選修三的介紹更加詳細，但其中還有很多的信息沒有提供，如連接酶是如何起到連接作用的，對哪些DNA分子起作用都沒有介紹，而目前高中階段生物學試題很多是以已知信息的形式提供給學生，當學生對某些知識不了解的時候很難提取信息并分析問題。這些情況可能會對教學以及學生的理解帶來一定的困難?；诖?，本文對DNA連接酶的種類、作用和作用機理進行總結，以期對教師的教學和學生對DNA連接酶作用過程的理解能起到一定的幫助。

1 DNA連接酶的發(fā)現

DNA連接酶最早于1967年由三個實驗室同時發(fā)現，經過科學家?guī)资甑难芯堪l(fā)現，目前在病毒、細菌和真核生物體內都發(fā)現了DNA連接酶，不同類型的DNA連接酶的作用機制不同。一般情況下，根據DNA連接酶催化反應所需的能量來源可以把DNA連接酶分為腺苷三磷酸（ATP）依賴型和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴型，腺苷三磷酸依賴型DNA連接酶廣泛存在于真核生物、古細菌、真細菌和病毒中，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴型DNA連接酶則分布在古細菌、真細菌和病毒中。最近研究發(fā)現，不同類型的DNA連接酶在系統(tǒng)演化上具有一定的聯(lián)系，所以研究DNA連接酶，不僅可以幫助我們了解DNA連接酶在DNA復制、重組和修復中的作用機制，同時也可以幫助我們研究物種的分布特點和系統(tǒng)演化規(guī)律[2-3]。

2 DNA連接酶的常見種類和作用機制

2.1 腺苷三磷酸（ATP）依賴型

2.1.1 T4DNA連接酶

T4DNA連接酶是目前應用比較多的病毒基因組編碼的DNA連接酶，在基因重組中廣泛使用。噬菌體類型較多，目前研究發(fā)現T4噬菌體能夠合成T4DNA連接酶，并且已經能夠從被T4嗜菌體感染的大腸桿菌中提取該酶，此外科學家也已經定位該酶的合成基因，即噬菌體T4的30基因。T4DNA連接酶具有連接黏性末端和平末端的作用，研究發(fā)現當以切口DNA、黏性末端和平末端DNA為底物時，T4DNA連接酶對切口DNA的親和力最大，而黏性末端DNA的親和力則大于平末端DNA，一般情況下T4DNA連接酶對平末端的連接效率很低。在科學研究中，為了提高連接平末端的效率，一般對平末端進行酶切形成黏性末端再進行連接[4]。經過不同科學家的研究，目前對DNA連接反應的基本機理有基本一致的觀點，即都是通過把雙鏈DNA分子切割后，暴露出切口，然后進行連接。研究人員總結DNA片段的連接過程，認為整個DNA連接反應可以通過三個連續(xù)步驟來完成：（1）ATP通過斷裂最后一個高能磷酸鍵釋放能量，同時產生的AMP和T4DNA連接酶利用ATP水解釋放的能量形成E-AMP復合物；（2）所形成的E-AMP復合物可以識別DNA雙鏈之前被切開的切口，識別之后AMP會脫離E-AMP復合物并與DNA的5’-P基團結合；（3）需要連接的另外一段DNA分子片段的3’-OH會攻擊第二步形成5’-P-AMP，3’-OH和磷酸基團殘基發(fā)生反應形成磷酸二酯鍵，同時釋放出一個AMP[5]。

2.1.2 真核生物DNA連接酶

真核生物存在3種ATP依賴型DNA連接酶——DNA連接酶Ⅰ、DNA連接酶Ⅲ和DNA連接酶Ⅳ。研究顯示，DNA連接酶Ⅰ和DNA連接酶Ⅳ廣泛分布于真核生物中，如植物界和動物界，DNA連接酶Ⅲ則主要分布于脊椎動物中[3]。

目前科學家認為，在真核生物DNA復制過程中，起到連接作用的可能主要是DNA連接酶Ⅰ，DNA連接酶Ⅰ活性的調節(jié)與其氨基端有關，在其氨基端靠近活性中心有一個特定的部位，該部位可以通過磷酸化作用來調節(jié)DNA連接酶Ⅰ的活性。DNA連接酶Ⅰ的作用就是將DNA復制時復制叉處形成的不連續(xù)的后隨鏈（岡崎片段）連接起來。在此過程中DNA連接酶Ⅰ并不是單獨起作用，而是需要和多種蛋白因子密切合作共同完成。在真核生物DNA復制時，后隨鏈是由DNA聚合酶α催化合成的，DNA聚合酶α先催化合成一段引物，然后依賴DNA聚合酶δ與增殖細胞核抗原（持續(xù)復制因子），從引物開始合成DNA，然后引物通過降解出去。此外，在損傷的DNA的堿基修復中，DNA連接酶Ⅰ也同樣起到重要的作用。首先細胞內的特異性的核酸內切酶和外切酶特異性識別損傷部位，在DNA單鏈損傷部位的附近進行剪切，切除一段DNA，然后DNA聚合酶以另一條完整的DNA鏈作為模版進行修復合成重新合成這段DNA，最后由DNA連接酶Ⅰ將缺口連接[2-3]。

哺乳動物DNA連接酶Ⅲ基因編碼兩種連接酶—連接酶Ⅲα和連接酶Ⅲβ,這兩種酶的區(qū)別在C端。DNA連接酶Ⅲ在核苷酸切除修復、堿基切除修復和單鏈斷裂修復等過程發(fā)揮作用。

DNA連接酶Ⅳ在非同源重組DNA雙鏈斷裂修復和免疫相關基因的重組中發(fā)揮功能，可與某種復合物相互作用，來維持穩(wěn)定和催化功能。

2.2 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴型

在自然界中的其他生物也可以通過以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸供能方式完成此過程，這種方式主要見于大腸桿菌和其他一些細菌的DNA連接酶的連接反應中。這種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴型連接DNA片段的反應步驟也可以分為三步：（1）由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸與DNA連接酶反應，形成腺苷酰化的酶；（2）腺苷?；皋D移出一分子AMP，該AMP與切開的DNA分子切口處的5’-P結合，形成5’-P-AMP；（3）和ATP依賴型DNA連接反應一樣，即另外一段DNA分子片段的3’-OH攻擊第二步形成5’-P-AMP，3’-OH和磷酸基團殘基發(fā)生反應形成磷酸二酯鍵，同時釋放出一個一磷酸腺苷（AMP）[6]。

3 體外DNA連接的常用方法

利用目前已知的DNA連接酶的連接特點，在具體的基因工程操作中，科研人員對DNA片段的連接方法有以下三種：（1）用限制性核酸內切酶酶切，形成具有黏性末端的DNA片段，利用DNA連接酶直接連接；（2）對于平末端的DNA片段的連接常利用T4DNA連接酶連接；（3）在DNA片段末端加上poly（dA）-poly（dT）尾，或化學合成的銜接物或接頭，使之形成黏性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。這三種方法的原理基本一樣，都是利用DNA連接酶形成磷酸二酯鍵來封閉DNA片段之間的間隙。

4 結語

DNA連接酶在不同生物體中都存在著不同類型的同工酶，并且都參與生物體內DNA的復制、修復和重組等環(huán)節(jié)，是生物體非常重要的酶。通過以上內容的介紹，可以簡單了解DNA連接酶的種類的作用機制，相信當掌握DNA連接酶的相關信息之后，對于教學中處理一些知識可以更加得心應手，同樣的學生對DNA連接酶的種類和作用機理的了解對學生解決一些基因工程類題目也起到一定的作用。隨著分子生物學的發(fā)展，DNA連接酶的研究仍在進行，很多知識仍在不斷地更新，為了跟上知識的發(fā)展和科技的進步，一線教師的知識儲備也要隨著科學的發(fā)展而更新，只有如此，下一代才能更好地面對未來。