徐廣志

（安徽省阜陽(yáng)市第三中學(xué)，安徽阜陽(yáng) 236000）

高中生物中的DNA連接酶首次出現(xiàn)是在必修二第六章第二節(jié)“基因工程及其應(yīng)用”中，其中介紹“脫氧核糖和磷酸交替連接而構(gòu)成的DNA骨架上的缺口，需要靠DNA連接酶來‘縫合’”，從簡(jiǎn)單的介紹中可以知道，DNA連接酶的作用是連接磷酸二酯鍵。再次出現(xiàn)時(shí)，是在生物選修三專題一“DNA重組技術(shù)的基本工具”中，這里介紹更為詳細(xì)，“DNA連接酶—‘分子縫合針’，將切下來的DNA片段拼接成新的DNA分子，是靠DNA連接酶來完成的。1967年，世界上幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀跬瑫r(shí)發(fā)現(xiàn)了一種能夠?qū)蓷lDNA鏈連接起來的酶，稱之為DNA連接酶（DNA ligase）。根據(jù)酶的來源不同，可以將這些酶分為兩類：一類是從大腸桿菌中分離得到的，稱為E.coil DNA連接酶；另一類是從T4噬菌體中分離出來的，稱為T4DNA連接酶。”[1]課本中介紹了DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)時(shí)間、酶的來源及不同DNA連接酶所起的作用，并提出“連接平末端之間的效率比較低”。雖然選修三的介紹更加詳細(xì)，但其中還有很多的信息沒有提供，如連接酶是如何起到連接作用的，對(duì)哪些DNA分子起作用都沒有介紹，而目前高中階段生物學(xué)試題很多是以已知信息的形式提供給學(xué)生，當(dāng)學(xué)生對(duì)某些知識(shí)不了解的時(shí)候很難提取信息并分析問題。這些情況可能會(huì)對(duì)教學(xué)以及學(xué)生的理解帶來一定的困難?；诖?，本文對(duì)DNA連接酶的種類、作用和作用機(jī)理進(jìn)行總結(jié)，以期對(duì)教師的教學(xué)和學(xué)生對(duì)DNA連接酶作用過程的理解能起到一定的幫助。

1 DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)

DNA連接酶最早于1967年由三個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過科學(xué)家?guī)资甑难芯堪l(fā)現(xiàn)，目前在病毒、細(xì)菌和真核生物體內(nèi)都發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶，不同類型的DNA連接酶的作用機(jī)制不同。一般情況下，根據(jù)DNA連接酶催化反應(yīng)所需的能量來源可以把DNA連接酶分為腺苷三磷酸（ATP）依賴型和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴型，腺苷三磷酸依賴型DNA連接酶廣泛存在于真核生物、古細(xì)菌、真細(xì)菌和病毒中，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴型DNA連接酶則分布在古細(xì)菌、真細(xì)菌和病毒中。最近研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的DNA連接酶在系統(tǒng)演化上具有一定的聯(lián)系，所以研究DNA連接酶，不僅可以幫助我們了解DNA連接酶在DNA復(fù)制、重組和修復(fù)中的作用機(jī)制，同時(shí)也可以幫助我們研究物種的分布特點(diǎn)和系統(tǒng)演化規(guī)律[2-3]。

2 DNA連接酶的常見種類和作用機(jī)制

2.1 腺苷三磷酸（ATP）依賴型

2.1.1 T4DNA連接酶

T4DNA連接酶是目前應(yīng)用比較多的病毒基因組編碼的DNA連接酶，在基因重組中廣泛使用。噬菌體類型較多，目前研究發(fā)現(xiàn)T4噬菌體能夠合成T4DNA連接酶，并且已經(jīng)能夠從被T4嗜菌體感染的大腸桿菌中提取該酶，此外科學(xué)家也已經(jīng)定位該酶的合成基因，即噬菌體T4的30基因。T4DNA連接酶具有連接黏性末端和平末端的作用，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)以切口DNA、黏性末端和平末端DNA為底物時(shí)，T4DNA連接酶對(duì)切口DNA的親和力最大，而黏性末端DNA的親和力則大于平末端DNA，一般情況下T4DNA連接酶對(duì)平末端的連接效率很低。在科學(xué)研究中，為了提高連接平末端的效率，一般對(duì)平末端進(jìn)行酶切形成黏性末端再進(jìn)行連接[4]。經(jīng)過不同科學(xué)家的研究，目前對(duì)DNA連接反應(yīng)的基本機(jī)理有基本一致的觀點(diǎn)，即都是通過把雙鏈DNA分子切割后，暴露出切口，然后進(jìn)行連接。研究人員總結(jié)DNA片段的連接過程，認(rèn)為整個(gè)DNA連接反應(yīng)可以通過三個(gè)連續(xù)步驟來完成：（1）ATP通過斷裂最后一個(gè)高能磷酸鍵釋放能量，同時(shí)產(chǎn)生的AMP和T4DNA連接酶利用ATP水解釋放的能量形成E-AMP復(fù)合物；（2）所形成的E-AMP復(fù)合物可以識(shí)別DNA雙鏈之前被切開的切口，識(shí)別之后AMP會(huì)脫離E-AMP復(fù)合物并與DNA的5’-P基團(tuán)結(jié)合；（3）需要連接的另外一段DNA分子片段的3’-OH會(huì)攻擊第二步形成5’-P-AMP，3’-OH和磷酸基團(tuán)殘基發(fā)生反應(yīng)形成磷酸二酯鍵，同時(shí)釋放出一個(gè)AMP[5]。

2.1.2 真核生物DNA連接酶

真核生物存在3種ATP依賴型DNA連接酶——DNA連接酶Ⅰ、DNA連接酶Ⅲ和DNA連接酶Ⅳ。研究顯示，DNA連接酶Ⅰ和DNA連接酶Ⅳ廣泛分布于真核生物中，如植物界和動(dòng)物界，DNA連接酶Ⅲ則主要分布于脊椎動(dòng)物中[3]。

目前科學(xué)家認(rèn)為，在真核生物DNA復(fù)制過程中，起到連接作用的可能主要是DNA連接酶Ⅰ，DNA連接酶Ⅰ活性的調(diào)節(jié)與其氨基端有關(guān)，在其氨基端靠近活性中心有一個(gè)特定的部位，該部位可以通過磷酸化作用來調(diào)節(jié)DNA連接酶Ⅰ的活性。DNA連接酶Ⅰ的作用就是將DNA復(fù)制時(shí)復(fù)制叉處形成的不連續(xù)的后隨鏈（岡崎片段）連接起來。在此過程中DNA連接酶Ⅰ并不是單獨(dú)起作用，而是需要和多種蛋白因子密切合作共同完成。在真核生物DNA復(fù)制時(shí)，后隨鏈?zhǔn)怯蒁NA聚合酶α催化合成的，DNA聚合酶α先催化合成一段引物，然后依賴DNA聚合酶δ與增殖細(xì)胞核抗原（持續(xù)復(fù)制因子），從引物開始合成DNA，然后引物通過降解出去。此外，在損傷的DNA的堿基修復(fù)中，DNA連接酶Ⅰ也同樣起到重要的作用。首先細(xì)胞內(nèi)的特異性的核酸內(nèi)切酶和外切酶特異性識(shí)別損傷部位，在DNA單鏈損傷部位的附近進(jìn)行剪切，切除一段DNA，然后DNA聚合酶以另一條完整的DNA鏈作為模版進(jìn)行修復(fù)合成重新合成這段DNA，最后由DNA連接酶Ⅰ將缺口連接[2-3]。

哺乳動(dòng)物DNA連接酶Ⅲ基因編碼兩種連接酶—連接酶Ⅲα和連接酶Ⅲβ,這兩種酶的區(qū)別在C端。DNA連接酶Ⅲ在核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)和單鏈斷裂修復(fù)等過程發(fā)揮作用。

DNA連接酶Ⅳ在非同源重組DNA雙鏈斷裂修復(fù)和免疫相關(guān)基因的重組中發(fā)揮功能，可與某種復(fù)合物相互作用，來維持穩(wěn)定和催化功能。

2.2 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴型

在自然界中的其他生物也可以通過以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸供能方式完成此過程，這種方式主要見于大腸桿菌和其他一些細(xì)菌的DNA連接酶的連接反應(yīng)中。這種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴型連接DNA片段的反應(yīng)步驟也可以分為三步：（1）由煙酰胺腺嘌呤二核苷酸與DNA連接酶反應(yīng)，形成腺苷?；拿?；（2）腺苷?；皋D(zhuǎn)移出一分子AMP，該AMP與切開的DNA分子切口處的5’-P結(jié)合，形成5’-P-AMP；（3）和ATP依賴型DNA連接反應(yīng)一樣，即另外一段DNA分子片段的3’-OH攻擊第二步形成5’-P-AMP，3’-OH和磷酸基團(tuán)殘基發(fā)生反應(yīng)形成磷酸二酯鍵，同時(shí)釋放出一個(gè)一磷酸腺苷（AMP）[6]。

3 體外DNA連接的常用方法

利用目前已知的DNA連接酶的連接特點(diǎn)，在具體的基因工程操作中，科研人員對(duì)DNA片段的連接方法有以下三種：（1）用限制性核酸內(nèi)切酶酶切，形成具有黏性末端的DNA片段，利用DNA連接酶直接連接；（2）對(duì)于平末端的DNA片段的連接常利用T4DNA連接酶連接；（3）在DNA片段末端加上poly（dA）-poly（dT）尾，或化學(xué)合成的銜接物或接頭，使之形成黏性末端之后，再用DNA連接酶將它們連接起來。這三種方法的原理基本一樣，都是利用DNA連接酶形成磷酸二酯鍵來封閉DNA片段之間的間隙。

4 結(jié)語(yǔ)

DNA連接酶在不同生物體中都存在著不同類型的同工酶，并且都參與生物體內(nèi)DNA的復(fù)制、修復(fù)和重組等環(huán)節(jié)，是生物體非常重要的酶。通過以上內(nèi)容的介紹，可以簡(jiǎn)單了解DNA連接酶的種類的作用機(jī)制，相信當(dāng)掌握DNA連接酶的相關(guān)信息之后，對(duì)于教學(xué)中處理一些知識(shí)可以更加得心應(yīng)手，同樣的學(xué)生對(duì)DNA連接酶的種類和作用機(jī)理的了解對(duì)學(xué)生解決一些基因工程類題目也起到一定的作用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA連接酶的研究仍在進(jìn)行，很多知識(shí)仍在不斷地更新，為了跟上知識(shí)的發(fā)展和科技的進(jìn)步，一線教師的知識(shí)儲(chǔ)備也要隨著科學(xué)的發(fā)展而更新，只有如此，下一代才能更好地面對(duì)未來。