楊曉玫，周 彤，阿 蕓，師尚禮，

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

綠色熒光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)為發(fā)光蛋白，最初在維多利亞多管水母中發(fā)現(xiàn)，吸收光譜的最大峰值為395 nm，為紫外光；發(fā)射光譜最大峰值為509 nm，呈現(xiàn)綠色熒光。gfp分子量小，對(duì)細(xì)胞無毒，只編碼238 氨基酸，不干擾標(biāo)記蛋白的功能和定位，其具有的特點(diǎn)性質(zhì)及熒光特性穩(wěn)定、檢測方便可靠的優(yōu)點(diǎn)，使gfp在細(xì)菌的分子標(biāo)記研究中的應(yīng)用非常廣泛。GFP基因標(biāo)記采用三親本雜交的方法，將供體菌、輔助菌和受體菌混合培養(yǎng)，用熒光顯微鏡選擇平板上長出的單菌落，肉眼可見接合子菌落發(fā)出的綠色熒光[1]。史巧娟[2]應(yīng)用gfp基因在華癸中生根瘤菌中的異源表達(dá)，構(gòu)建基于gfp的廣宿主范圍啟動(dòng)子探針載體，通過鳥槍克隆技術(shù)以gfp為報(bào)告基因原位活體監(jiān)測華癸中生根瘤菌侵染紫云英的早期結(jié)瘤過程。HumbertoJ O Ramos[3]應(yīng)用gusA和gfp基因標(biāo)記大豆根瘤菌，檢測其占瘤率[3]。

運(yùn)用三親本雜交方法的熒光標(biāo)記，即利用分子生物學(xué)手段將標(biāo)記熒光基因引入到目的根瘤菌中，從而利用導(dǎo)入根瘤菌的熒光基因所編碼的酶作用于多種底物而產(chǎn)生顏色反應(yīng)或發(fā)光現(xiàn)象，從而能夠比較直觀地跟蹤所要研究的目的根瘤菌。三親本雜交是在雙親本雜交的基礎(chǔ)上建立起來的。Chalfie 等[4]首次在果蠅、大腸桿菌等生物體內(nèi)成功表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)基因，因此，人們將攜帶有綠色熒光標(biāo)記的果蠅、大腸桿菌等生物體作為又一快速高效的研究工具，應(yīng)用于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，三親本雜交的方法得以廣泛的應(yīng)用。

目前，已有青色熒光蛋白成功運(yùn)用三親本雜交法構(gòu)建苜蓿cfp熒光標(biāo)記菌株，不影響苜蓿的固氮能力和植物生長指標(biāo)[5]，三親本雜交是應(yīng)用比較廣泛的接合轉(zhuǎn)移方法，但熒光資源短缺，一種顏色的熒光質(zhì)粒蛋白不便于同時(shí)多元化標(biāo)記。gfp熒光蛋白是cfp熒光蛋白的突變體，基于綠色熒光蛋白成功轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸桿菌并穩(wěn)定表達(dá)，以三親本雜交方法構(gòu)建gfp熒光標(biāo)記苜蓿根瘤菌的基礎(chǔ)上，通過無氮培養(yǎng)基和抗生素選擇平板對(duì)標(biāo)記株進(jìn)行篩選，對(duì)優(yōu)良菌株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性驗(yàn)證和回接鑒定，并通過測定回接植株的生物量、結(jié)瘤特性和發(fā)光根瘤的數(shù)量，探討優(yōu)良標(biāo)記株的熒光蛋白表達(dá)能力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 受體菌株為苜蓿根瘤菌RhizobiummelilotiGN5、苜蓿中華根瘤菌標(biāo)準(zhǔn)菌Sinorhizobiummeliloti12531和苜蓿中華根瘤菌標(biāo)準(zhǔn)菌Sinorhizobiummeliloti343。

苜蓿根瘤菌RhizobiummelilotiGN5分離自甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿(Medicagosativacv. Gannong No.5)種子，由教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，經(jīng)中科院微生物鑒定與保藏中心鑒定；苜蓿中華根瘤菌標(biāo)準(zhǔn)菌Sinorhizobiummeliloti12531和苜蓿中華根瘤菌標(biāo)準(zhǔn)菌Sinorhizobiummeliloti343,購自中國科學(xué)院微生物保藏中心。供體菌為含gfp熒光基因質(zhì)粒的大腸桿菌E.coliGFP104。輔助菌為大腸桿菌EscherrichiacolipRK2073。

1.1.2 培養(yǎng)基 YMA培養(yǎng)基用于根瘤菌的增殖培養(yǎng)，參照文獻(xiàn)[6]的方法配制。

TY(Yeast Tryptone Agar)培養(yǎng)基用于觀察檢測標(biāo)記菌株熒光表達(dá)能力，參照文獻(xiàn)[7]的方法配制。LB(Luria Bertani)培養(yǎng)基用于增值培養(yǎng)供體菌和輔助菌，參照文獻(xiàn)[8]的方法配制。SM(Supplemental Medium)培養(yǎng)基用于分離培養(yǎng)菌體，參照文獻(xiàn)[9]的方法配制。Winogradsky無氮固體培養(yǎng)基用于快速檢測接合子的固氮能力，參照文獻(xiàn)[10]的方法配制。 各種培養(yǎng)基均以121℃濕熱滅菌26 min。

含抗生素固體培養(yǎng)基的配制：抗生素溶液氨芐(Amp)和慶大霉素(Gm)各0.005 g，加入100 mL去離子水溶解后經(jīng)0.22 μm的無菌濾膜過濾，制成濃度為50 μg/mL的溶液。待配制的固體培養(yǎng)基冷卻至40℃時(shí)加入，制成TY/LB/SM含藥固體平板。

1.1.3 植物材料 甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿種子，由教育部草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，種子發(fā)芽率90.6%，凈度98.5%。

1.2 熒光標(biāo)記根瘤菌的構(gòu)建

三親本雜交法熒光標(biāo)記根瘤菌的構(gòu)建，混合菌體是在凌瑤[11]的方法上予以改進(jìn)，即在含慶大霉素(Gm)50 μg/mL和氨芐(Amp)50 μg/mL的LB固體培養(yǎng)基活化供體菌E.coli104和輔助菌E.coli2073。28℃培養(yǎng)16～18 h，分別轉(zhuǎn)接菌株到含50 μg/mL Gm和50 μg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、120 r/min搖床震蕩培養(yǎng)至菌體生長對(duì)數(shù)期(D600 nm=0.5)。將以上供體菌、輔助菌、受體菌的菌液各1.5 mL混合,8 000 r/min離心5 min得到混合菌體沉淀，棄上清液后向沉淀加入1 mL無抗生素TY液體培養(yǎng)基，振蕩混勻并8 000 r/min離心5 min，棄上清液后留混合菌體沉淀。

混合培養(yǎng)在TY固體平板表面每皿貼3片0.22 μm無菌濾膜，菌體沉淀加1 mL無菌水打散成濃菌液，加0.2 mL濃菌液至濾膜中央，28℃正置2 h后倒置培養(yǎng)。2～3 d后用鑷子取出已長出培養(yǎng)物的濾膜，放入無菌西林瓶中，5 mL無菌水洗菌體后用無菌水稀釋10倍，取0.2 mL菌液在SM+Gm固體平板上涂布，28℃培養(yǎng)7 d，挑取平板上50個(gè)單菌落，依次編號(hào)，分別點(diǎn)接于無抗生素TY培養(yǎng)基和無氮培養(yǎng)基，每菌株3次重復(fù)，28℃培養(yǎng)至菌落出現(xiàn)。檢測菌落后，在熒光顯微鏡下選擇可發(fā)綠色熒光單菌落的培養(yǎng)菌落轉(zhuǎn)接于無氮培養(yǎng)基，無氮平板上能正常生長的菌株則為熒光標(biāo)記根瘤菌(接合子)。

1.3 標(biāo)記根瘤菌的遺傳穩(wěn)定性檢測方法

甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿熒光標(biāo)記菌的篩選參照文獻(xiàn)[12]的方法，參照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行回接試驗(yàn)，盆栽試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)[14]，每菌株4次重復(fù)，對(duì)照組為不接菌的處理。每盆栽種5粒滅菌苜蓿種子，重復(fù)單個(gè)無菌沙培盆栽，出苗3 d后留苗一株。分別標(biāo)號(hào)后放入關(guān)照培養(yǎng)室，日常處理參照文獻(xiàn)[12]的方法，45 d后測定植株的株高、根長、生物量、根瘤重和單株結(jié)瘤數(shù)。

根瘤固氮酶活性測定：使用乙炔還原法等[15]的方法測定，進(jìn)樣溫度150℃，柱溫175℃，，F(xiàn)ID170℃，進(jìn)樣50 μL，每處理3次重復(fù)。

標(biāo)記菌占瘤率的測定：蒸餾水慢慢清洗苜蓿苗根系，最后用無菌水沖洗3～5次，收集苜蓿苗單株上的所有根瘤，表面滅菌后用熒光顯微鏡觀察，有綠色熒光的根瘤為熒光標(biāo)記株侵染形成[9]，按照以上方法，篩選出熒光蛋白表達(dá)能力強(qiáng)、占瘤率高、熒光質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定、固氮酶活性高且能使苜蓿植株生物量增加的熒光標(biāo)記菌株。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan法進(jìn)行數(shù)據(jù)的多重比較，采用Excel 2007制圖[16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光標(biāo)記根瘤菌接合子的構(gòu)建和初選

3種根瘤菌分別從SM+Gm平板上選出各20個(gè)可以在TY培養(yǎng)基上形成菌落的接合子，用熒光顯微鏡壓片觀察其熒光蛋白表達(dá)均出現(xiàn)綠色熒光(圖1)。

在S.meliloti12531菌株的接合子中，6個(gè)菌株的3次重復(fù)均能在無氮固體培養(yǎng)基上正常生長(表1)，表

2中R.melilotiGN5的8個(gè)菌株的3次重復(fù)均能在無氮培養(yǎng)基上生長，表3中R.meliloti343的4個(gè)菌株的3次重復(fù)均能在無氮培養(yǎng)基上生長，表明菌株的固氮能力能夠穩(wěn)定遺傳；綜合接合子的發(fā)光及生長特性，篩選出S.meliloti12531菌株的6個(gè)接合子,R.melilotiGN5菌株的8個(gè)接合子，R.meliloti343菌株的4個(gè)接合子，由此可見在SM+Gm上獲得的菌株大部分在傳代過程固氮性能并不穩(wěn)定，僅約13%的菌體可穩(wěn)定遺傳。因此，無氮培養(yǎng)基能很穩(wěn)定的篩選熒光標(biāo)記固氮菌株。

圖1 3種綠色熒光標(biāo)記根瘤菌在顯微鏡下的熒光表達(dá)Fig.1 Fluorescence expression of three green fluorescent protein labeled strains of rhizobia

接合子編號(hào)12345678910S.meliloti12531++++-++++---+++-++---+++++-+-+R.melilotiGN5+++++++++---+++--+---+++++++-+S.meliloti343+-+++++-+---+-+-++---++++----+接合子編號(hào)11121314151617181920S.meliloti12531--+---++++-++--+++--------+-+-R.melilotiGN5--+-+-++++--++-+++-------++---S.meliloti343-++---+--+-+++++++-------++++-

注:“+”表示接合子能在無氮培養(yǎng)基上生長，“-” 表示接合子不能在無氮培養(yǎng)基上生長，“+++”表示接合子3次重復(fù)均能在無氮培養(yǎng)基上生長，“---”表示接合子3次重復(fù)均不能在無氮培養(yǎng)基上生長，“+--”等表示接合子3次重復(fù)中不完全在無氮培養(yǎng)基上生長

2.2 熒光標(biāo)記根瘤菌的遺傳穩(wěn)定性

初選獲得的接合子在無抗生素的TY固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10次后，熒光質(zhì)粒的丟失率均低于10%(表2)，可見gfp熒光質(zhì)粒隨宿主菌的傳代能穩(wěn)定復(fù)制進(jìn)入下一代，說明與熒光質(zhì)粒的結(jié)合能力較好的菌株，固氮能力比較穩(wěn)定。其中丟失率為0的R.melilotiGN5-gfp2、R.melilotiGN5-gfp4、S.meliloti343-gfp2、S.meliloti12531-gfp2及S.meliloti12531-gfp的熒光蛋白表達(dá)能力也最強(qiáng)，最后進(jìn)行宿主植株回接試驗(yàn)。

2.3 熒光標(biāo)記根瘤菌的回接鑒定和篩選

接種標(biāo)記菌的苜蓿幼苗的生物量和株高與未接種植株(CK)有明顯的差異。其中，甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿回接中CK1-gfp2，CK2-gfp2及CK3-gfp4菌株的生物量高出對(duì)照74%～81%，與對(duì)照差異顯著(P<0.05)，紫花苜蓿343回接中CK1-gfp2，CK2-gfp4和CK3-gfp4菌株的生物量高出對(duì)照65%～87%，與對(duì)照差異顯著(P<0.05)(表3)。甘農(nóng)5號(hào)紫花苜?；亟又蠧K1-gfp2，CK2-gfp2和CK3-gfp4植株株高高出對(duì)照33%～85%，與對(duì)照差異顯著(P<0.05)，紫花苜蓿343回接中CK1-gfp2、CK2-gfp4及CK3-gfp4植株株高高出對(duì)照48%～82%，與對(duì)照差異顯著(P<0.05)。5株標(biāo)記菌回接植株的根長與對(duì)照差異顯著(P<0.05)(表4),表明苜蓿根瘤菌熒光標(biāo)記株和接種根瘤菌一樣能有效的促進(jìn)幼苗地上部分的生長，增加干物質(zhì)的積累和生物量，而與接種根瘤菌菌株之間無顯著的差異?？梢妰?yōu)良標(biāo)記菌額外的標(biāo)記質(zhì)粒要消耗碳水化合物，未顯著影響菌體對(duì)植株的促生作用，仍具備熒光的表達(dá)特性。因此，在優(yōu)良的標(biāo)記菌中，攜帶gfp熒光標(biāo)記基因質(zhì)粒的熒光表達(dá)效率高且耗能低。

表2 熒光質(zhì)粒丟失率

表3 標(biāo)記根瘤菌處理下甘農(nóng)5號(hào)苜蓿幼苗的生長

注：同列不同小寫字母表示同一生長指標(biāo)接種不同標(biāo)記菌的處理間差異顯著(P<0.05),CK為接種無菌水的對(duì)照，CK1為接種出發(fā)菌R.meliloti343苜蓿根瘤菌，CK2為接種出發(fā)菌R.meliloti12531苜蓿根瘤菌，CK3為接種出發(fā)菌R.melilotiGN5苜蓿根瘤菌，下同

表4 標(biāo)記根瘤菌處理下紫花苜蓿343苜蓿幼苗的生長

根瘤菌主要是侵染寄主植株形成有效根瘤，未接種對(duì)照根瘤的鮮重和數(shù)量等均較低，此次試驗(yàn)中篩選出5株熒光表達(dá)強(qiáng)度較高、回接植株根瘤數(shù)、固氮酶活性和單個(gè)根瘤鮮重較顯著的熒光標(biāo)記株(圖1)，其中，在甘農(nóng)5號(hào)紫花苜?；亟又蠧K1-gfp2，CK2-gfp2和CK3-gfp4的根瘤數(shù)高出對(duì)照20%～32%，固氮酶活性為對(duì)照的22.9～31.9倍，單個(gè)根瘤鮮重高出對(duì)照23%～30%，除CK1-gfp2處理占瘤率高于CK3-gfp4處理13.7%外，其他根瘤指標(biāo)與CK3-gfp4處理差異不顯著(P>0.05)，CK1-gfp2可作為甘農(nóng)5號(hào)的標(biāo)記菌株優(yōu)良菌株研究(表5)。在紫花苜蓿343回接中CK1-gfp2，CK2-gfp4及CK3-gfp4的根瘤數(shù)高出對(duì)照10%～78%，固氮酶活性為對(duì)照的28.9～39.3倍，單個(gè)根瘤鮮重高出對(duì)照35%～60%，除CK1-gfp2處理占瘤率高于CK3-gfp4處理7.04%外，其他根瘤指標(biāo)與CK2-gfp4處理差異不顯著(P>0.05)。依據(jù)植物促生能力、占瘤率和結(jié)瘤情況數(shù)據(jù)分析， 表明CK1-gfp2及CK2-gfp4可分別作為紫花苜蓿343的優(yōu)良標(biāo)記菌株用于更深研究(表6)。結(jié)果表明，三親本雜交后代的相同供體菌株中固氮能力和結(jié)瘤等之間的差異不顯著，說明三親本雜交方法質(zhì)粒通過輔助菌株接合受體菌株的整個(gè)過程，對(duì)不同接種根瘤菌菌株的固氮能力和結(jié)瘤能力未產(chǎn)生明顯的影響，能作為研究苜蓿根瘤菌的有效示蹤熒光。

表5 標(biāo)記根瘤菌對(duì)甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿幼苗根瘤的影響

表6 標(biāo)記根瘤菌對(duì)紫花苜蓿343幼苗根瘤的影響

3 討論

目前，國內(nèi)外對(duì)苜蓿根瘤菌優(yōu)良菌株的篩選頗有研究，已有報(bào)道用三親本雜交方法成功構(gòu)建出遺傳穩(wěn)定的cfp熒光標(biāo)記苜蓿根瘤菌[5]，三親本雜交是在雙親本雜交的基礎(chǔ)上，質(zhì)粒在輔助菌的協(xié)助下進(jìn)入受體菌，如將gfp熒光基因?qū)氲角噍镛D(zhuǎn)基因芽后能夠穩(wěn)定表達(dá)[17]。gfp是良好的細(xì)胞間信號(hào)傳遞的動(dòng)態(tài)標(biāo)記分子，有敏感的標(biāo)記檢測率[18]。研究中，運(yùn)用三親本雜交方法高效構(gòu)建遺傳穩(wěn)定的gfp熒光標(biāo)記根瘤菌，構(gòu)建的標(biāo)記根瘤菌在TY固體培養(yǎng)基上連續(xù)傳代10代后，gfp熒光質(zhì)粒的丟失率均低于10%。各出發(fā)菌與其綠色熒光標(biāo)記菌接種苜蓿幼苗的單株生物量、根長、株高和固氮酶活性等均顯著(P<0.05)高于未接種的處理，說明出發(fā)菌與其熒光標(biāo)記菌均具有明顯的促生作用，且熒光標(biāo)記根瘤菌不會(huì)對(duì)苜蓿幼苗的根系產(chǎn)生影響。

三親本雜交法中，培養(yǎng)基上出現(xiàn)的假接合子很難區(qū)分。試驗(yàn)中，假接合子或喪失固氮能力的標(biāo)記菌株比例較高，用反復(fù)的形式觀察和宿主回接試驗(yàn)是否結(jié)瘤，太過復(fù)雜耗時(shí)[9]。因此，借助根瘤菌在無氮培養(yǎng)基上正常生長的特性，用無氮和TY固體培養(yǎng)基同步驗(yàn)證菌種的固氮和發(fā)光特性，同時(shí)也驗(yàn)證了陳力玉等[5]的研究結(jié)果，簡化了篩選驗(yàn)證的流程，提高了標(biāo)記菌選育效率，具有良好的應(yīng)用前景。

4 結(jié)論

綠色熒光標(biāo)記根瘤菌接種苜蓿幼苗的單株生物量、株高和根長等與對(duì)應(yīng)的出發(fā)菌相比，無顯著差異，表明熒光質(zhì)粒的導(dǎo)入沒有影響菌株對(duì)苜蓿幼苗生物量積累的促進(jìn)效果。外源質(zhì)粒對(duì)菌株共生固氮能力的影響可能是促進(jìn)、也可能是抑制[19]。一些根瘤菌在導(dǎo)入外源質(zhì)粒后侵染結(jié)瘤和共生固氮能力會(huì)顯著提升[20]，可使宿主植株的生物量、根瘤鮮重及植株含氮量增加[21]。試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)對(duì)標(biāo)記菌株的結(jié)瘤及促生能力進(jìn)行驗(yàn)證很重要，僅次于熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度。同一出發(fā)菌株的熒光標(biāo)記菌結(jié)瘤能力和固氮酶活性無較大的差異。

在固氮能力指標(biāo)中，綠色熒光標(biāo)記根瘤菌和對(duì)應(yīng)的出發(fā)菌與其對(duì)照在接種的苜蓿幼苗的生物量、根瘤數(shù)、根瘤固氮酶活性、單個(gè)根瘤鮮重和占瘤率方面的表現(xiàn)有明顯差異。甘農(nóng)5號(hào)紫花苜?；亟又蠧K1-gfp2，CK2-gfp2和CK3-gfp4菌株的生物量高出對(duì)照74%～81%，根瘤數(shù)高出對(duì)照20%～32%，單個(gè)根瘤鮮重高出對(duì)照23%～30%，固氮酶活性為對(duì)照的22.9～31.9倍，與對(duì)照差異顯著(P<0.05)，紫花苜蓿343回接中CK1-gfp2，CK2-gfp4和CK3-gfp4菌株的生物量高出對(duì)照65%～87%，根瘤數(shù)高出對(duì)照10%～78%，單個(gè)根瘤鮮重高出對(duì)照35%～60%，固氮酶活性為對(duì)照的28.9～39.3倍，與對(duì)照差異顯著(P<0.05)。

研究最終獲得了理想的標(biāo)記根瘤菌，形成的根瘤的熒光表達(dá)能力強(qiáng)，與未接種菌株易于區(qū)分(圖1)，與未接種相比有良好的促生能力，其中甘農(nóng)5號(hào)紫花苜蓿標(biāo)記菌株CK1-gfp2、紫花苜蓿343標(biāo)記菌株CK1-gfp2及CK2-gfp4熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度、占瘤率、根瘤的固氮酶活性等均高出其他標(biāo)記菌株，可用于進(jìn)一步的根瘤菌示蹤研究。

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