史 毅，牛奎舉，馬暉玲

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 草業(yè)學(xué)院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/甘肅省草業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室/中-美草地畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展研究中心，甘肅 蘭州 730070)

植物根際益生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)是可寄生在植物根際并且具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)能力的一類細(xì)菌的總稱[1-2]。PGPR被發(fā)現(xiàn)有促生能力后，相關(guān)報(bào)道指出在植物根部施加根際益生菌可提高植物的抗病能力[3-6]。2003～2004年，Ryu等[7-8]首次報(bào)道PGPR的揮發(fā)性化合物可作為誘導(dǎo)劑，促進(jìn)擬南芥的生長(zhǎng)并且對(duì)抗病性有幫助，同時(shí)分析了PGPR揮發(fā)性化合物的成分，發(fā)現(xiàn)2，3-丁二醇是主要組成物，證明了人工合成2，3-丁二醇與PGPR揮發(fā)性化合物有同樣的促生和抗病誘導(dǎo)效果[7-8]。從而開啟了眾多植物學(xué)家利用PGPR揮發(fā)性化合物誘導(dǎo)植物抗病性的研究[9]。

匍匐翦股穎褐斑病病原為立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)，多發(fā)于夏季，該菌是一種土壤習(xí)居菌，為無性繁殖，傳播迅速，冷暖季型禾本科草坪草上該病害均發(fā)生[10]。為了控制草坪病害，殺菌劑的使用越來越頻繁，但大量使用殺菌劑不但成本高而且嚴(yán)重污染環(huán)境。所以，研究人員開始致力于發(fā)現(xiàn)安全的替代品來控制草坪病害。PGPR揮發(fā)性化合物是一種極有前景的植物真菌病害控制劑，然而其誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性的作用機(jī)理尚不清楚，對(duì)其作用機(jī)理的深入了解是將相關(guān)化合物應(yīng)用于實(shí)際的前提。

植物的誘導(dǎo)抗性主要分兩類，植物系統(tǒng)獲得抗性(Systemic acquired resistance,SAR)和植物誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(Induced systemic resistance,ISR)。SAR通常報(bào)道為由水楊酸信號(hào)通路和NPR1(Nonexpresser of PR genes)基因的誘導(dǎo)產(chǎn)生，并且基于植物病程相關(guān)蛋白(Pathogenesis-Related genes,PR)的誘導(dǎo)而起作用[11]。而ISR通常與茉莉酸/乙烯(JA/ET)信號(hào)通路有關(guān)[12]。PGPR及其揮發(fā)性化合物誘導(dǎo)產(chǎn)生的植物抗病性大多報(bào)道為ISR類型，通過JA/ET通路傳播信號(hào)，引起植物全面廣譜的抵抗能力。然而利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析單子葉植物被細(xì)菌揮發(fā)性化合物處理后引起植物抗病性機(jī)理的研究報(bào)道較少。

抗病誘導(dǎo)過程中，植物基因表達(dá)的變化，是誘導(dǎo)抗病性產(chǎn)生的根本原因，而基因表達(dá)的變化由調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子(Transcript factors,TFs)與位于基因啟動(dòng)子前的順式表達(dá)元件的結(jié)合而產(chǎn)生。TFs在植物生長(zhǎng)發(fā)育，以及逆境脅迫發(fā)揮重要作用。

通過對(duì)匍匐翦股穎被誘抗劑2，3-丁二醇處理前后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析，發(fā)掘匍匐翦股穎ISR抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，并研究其表達(dá)模式，將為誘抗劑應(yīng)用于實(shí)際和匍匐翦股穎抗病基因資源的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 植物材料制備及處理

匍匐翦股穎(Agrostisstolonifera)商用品種“PennA4”，由北京克勞沃公司提供。種子經(jīng)浸泡消毒后自然風(fēng)干，以滅菌的沙土混合物(1∶2)為基質(zhì)，種于240 mL組培瓶中，每瓶均勻撒入0.25 g種子，封口膜遮蓋，在甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院恒溫培養(yǎng)室中培養(yǎng)，溫度為20℃晝/18℃夜，光周期為16 h晝/8 h夜。生長(zhǎng)2周后，用注射器分別將10 mL濃度為150,250,350,450, 和550 μmol/L的2，3-丁二醇溶液施加在匍匐翦股穎植株貼近土壤部位，以蒸餾水為對(duì)照，每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.2 病原菌接種及病情分析

采用Cortes-barco等[13]的接菌物制備方法，利用麥粒培養(yǎng)基制備立枯絲核菌接菌物，并將其打碎研磨成粉末。2，3-丁二醇處理后第7 d對(duì)植物材料進(jìn)行接菌，接菌時(shí)，先從瓶口向內(nèi)噴水霧，使植物葉片濕潤(rùn)，然后向葉片撒播接菌物粉末，每瓶0.1 g，使其均勻分布在瓶?jī)?nèi)植物的葉片上。封口膜遮蓋培養(yǎng)于恒溫培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件同前，每天觀察病情。以目測(cè)發(fā)病葉片的發(fā)病面積總和占所有葉片面積的百分比為病癥面積百分比，以病原菌菌絲生長(zhǎng)面積占所有葉片面積的百分比為菌絲所占面積，以此2個(gè)指標(biāo)共同評(píng)價(jià)草坪草病情。

1.3 丁二醇對(duì)病原菌直接抑制作用測(cè)試

將生長(zhǎng)在PDA培養(yǎng)基的立枯絲核菌切下5 mm菌塊，置于添加0，50，500，1 000，5 000 μmol/L 2，3-丁二醇的PDA培養(yǎng)基上，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)重復(fù)，平板置于28℃培養(yǎng)9 d，每天觀測(cè)真菌生長(zhǎng)狀況。

1.4 測(cè)序樣品準(zhǔn)備和RNA提取

植物材料使用2，3-丁二醇處理前(0 d)，處理后1 d，處理后4 d，處理后7 d即接菌前，分別取樣，各4個(gè)重復(fù)，每瓶?jī)?nèi)所有葉片為一個(gè)樣，剪取葉片用錫箔紙包裹后迅速置于液氮中低溫保存。所有樣品用植物RNA提取試劑盒(OMEGA)提取RNA。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，測(cè)量濃度，RIN(RNA integrity number)指數(shù)后選擇完整性好，純度濃度高，RIN>6.3的RNA樣品用于建庫測(cè)序。

1.5 建庫和測(cè)序

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的RNA樣品，分別由4個(gè)重復(fù)樣品混合而成，用于構(gòu)建cDNA庫。測(cè)序使用Illumina HiSeq平臺(tái)，由諾禾致源公司(中國，北京)完成。

1.6 轉(zhuǎn)錄組組裝

測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)(raw reads)使用FASTQC確定待分析數(shù)據(jù)(clean reads)質(zhì)量，Trinity用于轉(zhuǎn)錄本的從頭組裝(De novo assembly)，然后使用CD-HIT(http:∥weizhongli-lab.org/cd-hit/)選取相似類中最長(zhǎng)的作為唯一基因，得到所有基因序列集合(Unigene)作為分析基因表達(dá)量的參考序列[14](reference sequences)。

1.7 差異表達(dá)基因(Differential expression genes,DEGs)數(shù)字分析及熒光定量PCR分析

用測(cè)序得到的各庫clean reads映射(map)于組裝得到的參考轉(zhuǎn)錄組，然后使用DEGseq對(duì)各Unigene在各庫的reads數(shù)量(均一化后)進(jìn)行分析，以|log2(foldchange)|>1，qvalue<0.005為閾值選取差異表達(dá)基因。使用iTAK[15](http:∥bioinfo.bti.cornell.edu /tool/itak)軟件查找所有差異表達(dá)基因中的轉(zhuǎn)錄因子。選取抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因20個(gè)，引物設(shè)計(jì)見表1，使用SYBR Green染料進(jìn)行熒光定量PCR，利用ΔΔCT法得到各基因在各植物樣本中的表達(dá)量。20 mL反應(yīng)體系，SYBR 10 m，上下游引物各0.8 mL，模板5 mL，去離子水3.4 mL。反應(yīng)條件95℃ 10 min;40 cycles為95℃ 15 s,57℃ 1 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 立枯絲核菌侵染后匍匐翦股穎病情分析

2，3-丁二醇處理后的植株與對(duì)照出現(xiàn)褐斑病害的癥狀以及時(shí)間并無區(qū)別，直到接菌后的第4 d，不同濃度丁二醇處理植株以及對(duì)照之間病情仍無顯著區(qū)別，接菌后第7及第10 d，丁二醇處理過的植株的疾病癥狀顯著少于對(duì)照(圖1)。尤其250 μmol/L 2，3-丁二醇比其他濃度表現(xiàn)出對(duì)病癥更大的抑制作用。丁二醇對(duì)病原菌直接抑制作用測(cè)試顯示添加在PDA平板中的2，3-丁二醇，無論濃度高低，對(duì)立枯絲核菌生長(zhǎng)無影響(圖2，3)。

表1 qRT-PCR驗(yàn)證基因選擇及引物設(shè)計(jì)

圖1 接菌10 d后的匍匐翦股穎發(fā)病狀況Fig.1 The disease occurrence of creeping bentgrass after inoculation for 10 days注：圖中左上，250 μmol/L 2，3-丁二醇處理未接菌植株；左下，水處理未接菌植株；右上，250 μmol/L 2，3-丁二醇處理接菌植株；右下，水處理接菌植株

圖2 高濃度丁二醇在PDA培養(yǎng)基上處理下立枯絲核菌的生長(zhǎng)Fig.2 Effect of 2,3-butanediol in high concentration on R.solanidevelopment on PDA medium

基于以上病情分析及丁二醇直接作用于病原菌的

圖3 不同濃度2，3-丁二醇處理下葉片的顯癥面積和菌絲覆蓋面積Fig.3 Effect of 2,3-butanediol on plant leaf percent area of lesions and mycelium注：圖中左為各濃度2，3-丁二醇對(duì)葉片顯癥面積的不同影響；右為各濃度丁二醇對(duì)立枯絲核菌

結(jié)果，丁二醇對(duì)病原菌無直接影響，而是可誘導(dǎo)植物自身產(chǎn)生抗病性，且250 μmol/L 2，3-丁二醇誘導(dǎo)作用最明顯，所以，植物轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析采用250 μmol/L 2，3-丁二醇作為處理劑。

2.2 轉(zhuǎn)錄組組裝及差異基因分析

利用Illumina 2×150 bp 雙端測(cè)序共測(cè)得258,606和402條reads，產(chǎn)生25Gb數(shù)據(jù)，去除接頭和低質(zhì)量序列后，得到252,117和292條高質(zhì)量待分析reads。經(jīng)Trinity從頭組裝后，得到466,761條轉(zhuǎn)錄本。過半數(shù)的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度為700 bp，組裝結(jié)果顯示N50=1 100。選擇334,212條轉(zhuǎn)錄本(所有轉(zhuǎn)錄本的71.60%)作為Unigene，平均長(zhǎng)度573 bp，N50=791 bp。比較得到各庫相較于0DPT，有一定的上調(diào)表達(dá)和下調(diào)表達(dá)基因(圖4)?？梢钥闯?，經(jīng)2，3-丁二醇處理后隨著時(shí)間變化，差異表達(dá)基因逐漸增多，且下調(diào)表達(dá)基因明顯多于上調(diào)基因。

2.3 差異基因的轉(zhuǎn)錄因子分類

利用iTAK軟件從所有差異表達(dá)基因中挑選得到32個(gè)表達(dá)量發(fā)生變化的轉(zhuǎn)錄因子。其中下調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子明顯多于上調(diào)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子。上調(diào)表達(dá)基因中的轉(zhuǎn)錄因子主要?dú)w類為bHLH，MYB，NAC和C2C2-CO-like等轉(zhuǎn)錄因子家族，還有3個(gè)基因可被定義為Orphans轉(zhuǎn)錄因子，即功能不明確的轉(zhuǎn)錄因子。下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子可歸類至13個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，其中最多的是HSF家族，其次為AP2-EREBP家族(表2)。

圖4 經(jīng)2，3-丁二醇處理1,4和7 d后匍匐翦股穎轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因Fig.4 The number of DEGs of creeping bentgrass transcriptome caused by 2,3-butanediol on 1 d,4 d and 7 d after treatment

表2 匍匐翦股穎差異基因中轉(zhuǎn)錄因子家族信息

2.4 抗病相關(guān)差異轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)變化

差異表達(dá)基因可以注釋到的轉(zhuǎn)錄因子中，大多為與植物抗逆和抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，但仍有一些未見與逆境相關(guān)的報(bào)道，試驗(yàn)中挑出與植物抗病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，并對(duì)其在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈持續(xù)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子有bHLH，C2C2-CO-like，1個(gè)NAC和1個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子。在4個(gè)時(shí)間點(diǎn)呈現(xiàn)上調(diào)再下調(diào)表達(dá)的有WRKY和3個(gè)AP2-EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子。呈顯著下調(diào)的是Bzip，C2H2，C3H，1個(gè)NAC，HSF的10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子(圖5)。

圖5 匍匐翦股穎差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子中抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)模式Fig.5 The expression pattern of defense related TFs in the DEGs of creeping bentgrass transcriptome

2.5 qRT-PCR 驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq的準(zhǔn)確性，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)20個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因在各時(shí)間點(diǎn)的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行了分析(圖6)。選取的20個(gè)基因中包括與抗病相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的所有家族，其中10個(gè)HSF轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)趨勢(shì)一致，所以只選取3個(gè)做驗(yàn)證。MYB轉(zhuǎn)錄因子的c201356_g2轉(zhuǎn)錄本的實(shí)際表達(dá)量未像RNA-seq分析結(jié)果表現(xiàn)出的先下調(diào)再恢復(fù)的趨勢(shì)，但整體呈下調(diào)后平穩(wěn)的趨勢(shì)，可以認(rèn)為兩種結(jié)果相似。AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子的c191406_g3和c186000_g1轉(zhuǎn)錄本雖不像RNA-seq結(jié)果在第4 d呈明顯上調(diào)，而是在第1 d就出現(xiàn)顯著上調(diào)，但整體趨勢(shì)仍是先上調(diào)后下調(diào)，與RNA-seq一致。HSF轉(zhuǎn)錄因子的c202855_g1轉(zhuǎn)錄本實(shí)際表達(dá)量表現(xiàn)出先下調(diào)后恢復(fù)，與RNA-seq結(jié)果稍顯不一致，但最終表達(dá)量為小幅度下調(diào)。所以經(jīng)20個(gè)基因的實(shí)時(shí)熒光定量驗(yàn)證，實(shí)際表達(dá)量與RNA-seq分析一致，說明RNA-seq分析結(jié)果有較高的可信度。

3 討論

誘抗劑誘導(dǎo)植物產(chǎn)生對(duì)病原體的廣譜抗性主要是由于其對(duì)植物基因表達(dá)產(chǎn)生的影響，轉(zhuǎn)錄因子是植物細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵因子，也稱反式作用因子，是指能夠與基因啟動(dòng)子區(qū)域中順式作用原件發(fā)生特異性相互作用的DNA結(jié)合蛋白，通過他們之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用激活或抑制某些基因的轉(zhuǎn)錄[16]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)2，3-丁二醇處理后，匍匐翦股穎對(duì)草坪草褐斑病病原R.Solani產(chǎn)生了誘導(dǎo)性抗性，為了對(duì)其誘導(dǎo)機(jī)理有一定了解，利用RNA-seq方法對(duì)匍匐翦股穎葉片在丁二醇處理前后的不同時(shí)間點(diǎn)樣品的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序分析，找到差異表達(dá)基因，并利用生物信息學(xué)軟件找到差異基因中的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而分析差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子如何調(diào)控匍匐翦股穎誘導(dǎo)抗性的產(chǎn)生。

圖6 部分匍匐翦股穎抗病相關(guān)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子qRT-PCR驗(yàn)證表達(dá)量Fig.6 TheqRT-PCR of part of the defense related TFs of creeping bentgrass

差異基因數(shù)量分析發(fā)現(xiàn)，隨著丁二醇處理時(shí)間的延長(zhǎng)，差異基因數(shù)量逐漸增多，由處理1 d的上調(diào)表達(dá)49個(gè)基因、下調(diào)表達(dá)141個(gè)基因增長(zhǎng)至處理7 d后的上調(diào)表達(dá)149個(gè)、下調(diào)表達(dá)272個(gè)基因。且不管處理時(shí)間為幾天，下調(diào)表達(dá)基因始終多于上調(diào)表達(dá)基因。這與Pan等[17]的研究結(jié)果一致，他用外源細(xì)胞分裂素處理麻風(fēng)樹2，4和22 h后對(duì)其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，與未處理植株相比其表達(dá)下調(diào)基因明顯多于表達(dá)上調(diào)基因。2，3-丁二醇雖與細(xì)胞分裂素不是同一種物質(zhì)，但其同樣有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的作用，外源化合物處理植物出現(xiàn)下調(diào)基因明顯多于上調(diào)基因并不少見，在多種植物的外源處理誘導(dǎo)研究中均有發(fā)現(xiàn)。下調(diào)基因可能引起某些物質(zhì)表達(dá)量的減少，但不代表調(diào)控能力的下降，下調(diào)的調(diào)控物質(zhì)有可能減少對(duì)某些基因的抑制作用，反而起到上調(diào)的作用。

轉(zhuǎn)錄因子根據(jù)DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的差異，可以分成不同的基因家族，如C2H2鋅指蛋白，bZIP，MYB，WRKY，NAC和HSF。研究中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子，并且有過與植物抗病相關(guān)報(bào)道的包括以下家族：bHLH，Bzip，C2C2-CO-like，C2H2，C3H，NAC，WRKY，MYB，AP2-EREBP和HSF。

上調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子有bHLH，C2C2-CO-like，1個(gè)NAC，和1個(gè)MYB。其中bHLH轉(zhuǎn)錄因子全稱為Basic helix-loop-helix堿性-螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族。這一類轉(zhuǎn)錄因子在植物中扮演重要的角色，它們常常比較保守，有研究表明bHLH轉(zhuǎn)錄因子參與擬南芥等模式植物的所有與茉莉酸信號(hào)調(diào)節(jié)途徑相關(guān)的生物進(jìn)程中[18]。該家族包含一個(gè)MYC2轉(zhuǎn)錄因子，它參與主要的茉莉酸相關(guān)調(diào)節(jié)，并且是ISR誘導(dǎo)途徑中的主要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子[19]。研究中bHLH轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)表達(dá)，可估計(jì)與植物ISR誘導(dǎo)呈正相關(guān)。C2C2-CO-like，C2H2和C3H轉(zhuǎn)錄因子是主要的鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子家族。鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道與植物逆境響應(yīng)的調(diào)節(jié)相關(guān)[20]。其中C2H2被報(bào)道可調(diào)控PGPR誘導(dǎo)植物過程中的基因轉(zhuǎn)錄[21]。研究中只有C2C2-CO-like轉(zhuǎn)錄因子上調(diào)表達(dá)，而C2H2和C3H轉(zhuǎn)錄因子均為下調(diào)表達(dá)。這有可能是由于植物體尚未遇到病原菌侵染，所以相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子只有一部分上調(diào)表達(dá)。NAC蛋白是一種植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族，被證明有多重生物學(xué)功能[22]。有報(bào)道證明擬南芥NAC蛋白ATAF2可抑制病程相關(guān)基因的表達(dá)[23]。然而另有研究指出植物過表達(dá)兩個(gè)NAC蛋白可調(diào)節(jié)茉莉酸誘導(dǎo)的抗性相關(guān)基因的表達(dá)[24]。研究中，兩個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子在2，3-丁二醇處理后，一個(gè)呈上調(diào)表達(dá)而另一個(gè)下調(diào)表達(dá)，此結(jié)果正好與PGPR誘導(dǎo)植物產(chǎn)生ISR的信號(hào)途徑有關(guān)，上調(diào)表達(dá)的NAC轉(zhuǎn)錄因子可能抑制了病程相關(guān)蛋白的表達(dá)，并提高了其他茉莉酸相關(guān)抗性基因的表達(dá)，從而使植物產(chǎn)生ISR。MYB轉(zhuǎn)錄因子最早發(fā)現(xiàn)于歐芹的抗病相關(guān)基因苯丙氨酸解氨酶(PAL)和4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)的調(diào)節(jié)過程中[25]，證明有一類MYB轉(zhuǎn)錄因子與植物抗病是正調(diào)節(jié)關(guān)系。研究中2個(gè)上調(diào)表達(dá)的MYB轉(zhuǎn)錄因子可能屬于這一類。

試驗(yàn)中呈先上調(diào)再下調(diào)表達(dá)的有WRKY和3個(gè)AP2-EREBP家族轉(zhuǎn)錄因子。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族被證明是擬南芥抗病轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中所必須的，然而除了一些WRKY轉(zhuǎn)錄因子是基礎(chǔ)抗性和植物R-基因調(diào)節(jié)所必須的，還有一部分WRKY與植物抗性呈負(fù)調(diào)節(jié)關(guān)系[26]。研究中2個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子呈先上調(diào)后下調(diào)表達(dá)，可能是因?yàn)檫@2個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子為短期響應(yīng)因子，而在其情況下呈現(xiàn)負(fù)調(diào)節(jié)作用。

呈顯著下調(diào)的是Bzip，C2H2，C3H，1個(gè)NAC和10個(gè)HSF轉(zhuǎn)錄因子，其中Bzip轉(zhuǎn)錄因子包含一個(gè)基本的保守結(jié)構(gòu)域和一個(gè)亮氨酸發(fā)卡結(jié)構(gòu) (leucine zipper)，該家族分為幾個(gè)大類，有大量的證據(jù)表明，該轉(zhuǎn)錄因子家族參與調(diào)控生物及非生物脅迫相關(guān)代謝途徑，其中D類Bzip轉(zhuǎn)錄因子被報(bào)道參與植物病程相關(guān)蛋白表達(dá)的誘導(dǎo)過程[27]，即植物SAR的產(chǎn)生。然而丁二醇誘導(dǎo)的植物ISR與病程相關(guān)蛋白并無關(guān)系，所以研究中一個(gè)Bzip基因的下調(diào)表達(dá)也正好可以證明這一點(diǎn)。HSF和AP2-EREBP轉(zhuǎn)錄因子均為植物逆境情況下誘導(dǎo)表達(dá)的常見轉(zhuǎn)錄因子[28-29]，然而在研究中10個(gè)HSF轉(zhuǎn)錄因子和4個(gè)AP2-EREBP，除了3個(gè)AP2基因早期呈現(xiàn)出先上調(diào)后下調(diào)的趨勢(shì)，其余均呈顯著下調(diào)表達(dá)，可能是沒有病原菌的介入，2，3-丁二醇直接施入尚不足以使植物產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。這也是本研究的新的發(fā)現(xiàn)，尚未有研究報(bào)道過PGPR或其揮發(fā)性化合物的施加會(huì)引起AP2-EREBP和HSF轉(zhuǎn)錄因子的大幅度下調(diào)表達(dá)。

4 結(jié)論

經(jīng)過2，3-丁二醇的噴施誘導(dǎo)，匍匐翦股穎植株可產(chǎn)生對(duì)草坪草褐斑病病原立枯絲核菌的抗性，繼而通過對(duì)匍匐翦股穎被誘抗劑2，3-丁二醇處理前后的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較分析，發(fā)掘匍匐翦股穎ISR抗性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，并研究它們的表達(dá)模式。發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)過程中，隨著誘導(dǎo)時(shí)間遞增，差異表達(dá)基因增多，其中32個(gè)轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因可歸類為13個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族?？共∠嚓P(guān)的轉(zhuǎn)錄因子27個(gè)可歸類為bHLH，Bzip，C2C2-CO-like，C2H2，C3H，NAC，WRKY，MYB，AP2-EREBP和HSF共10個(gè)基因家族。這10個(gè)家族的轉(zhuǎn)錄因子表現(xiàn)為不同的表達(dá)模式，共同作用于匍匐翦股穎的ISR誘導(dǎo)。同時(shí)實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的準(zhǔn)確性。結(jié)論為植物誘抗劑的實(shí)際應(yīng)用和匍匐翦股穎抗病基因資源的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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