(青島大學(xué)附屬醫(yī)院病理科,山東 青島 266003)

BRAF基因是RAF家族成員，其基因突變可以激活下游的信號(hào)傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞增殖與調(diào)節(jié)功能紊亂，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[1-2]。研究顯示結(jié)直腸癌中BRAF的突變率為5%～20%，其中90%以上為V600E突變[3-4]。BRAF V600E不僅是散發(fā)性微衛(wèi)星不穩(wěn)定性結(jié)直腸癌的重要標(biāo)記物[5-6]，且其與結(jié)直腸癌病人預(yù)后相關(guān)[7-8]，并能預(yù)測(cè)靶向藥物的療效[9-11]。因此，對(duì)BRAF突變進(jìn)行準(zhǔn)確和快速檢測(cè)，對(duì)結(jié)直腸癌病人的診斷及治療有著重要的意義。大量研究表明，BRAF VE1免疫組化抗體檢測(cè)甲狀腺乳頭狀癌及黑色素瘤中BRAF V600E基因突變具有較高的靈敏度及特異度[12-14]。而目前關(guān)于BRAF VE1抗體檢測(cè)結(jié)直腸癌中BRAF V600E基因突變的研究結(jié)果卻存在很大的爭(zhēng)議，主要表現(xiàn)在特異度較低[15]、癌組織的非特異性的細(xì)胞核及正常腺體著色[16-17]。而且其優(yōu)化的染色條件也需要進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)免疫組化染色儀探討合適的BRAF VE1抗體免疫組化染色條件，并評(píng)估免疫組化方法檢測(cè)結(jié)直腸癌BRAF V600E基因突變的診斷靈敏度和特異度?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

隨機(jī)收集我院病理科2014—2016年接受手術(shù)治療的116例原發(fā)性結(jié)直腸癌病人的標(biāo)本。病人手術(shù)前均未行放化療及靶向治療；標(biāo)本均經(jīng)常規(guī)病理診斷確診。

1.2 免疫組化染色及判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1免疫組化染色 標(biāo)本經(jīng)40 g/L中性緩沖甲醛溶液固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm厚切片。采用Benchmark XT(Roche公司)全自動(dòng)免疫組化儀對(duì)切片進(jìn)行BRAF V600E(鼠單克隆，克隆號(hào)VE1，貨號(hào)790-4855，Roche公司)免疫組化染色。具體步驟：切片72 ℃脫蠟4 min，氧化抑制4 min，然后以EDTA緩沖液(pH 8.0) 99 ℃抗原修復(fù)32 min(其中4例經(jīng)過測(cè)序證實(shí)V600E狀態(tài)的標(biāo)本，包括2例BRAF V600E突變型，2例BRAF V600E野生型，抗原修復(fù)時(shí)間分別為24、32、40、48、56和64 min，并采用抗BRAF V600E(VE1)鼠單克隆抗體進(jìn)行BRAF V600E蛋白檢測(cè))；OptiView HRP Linker孵育12 min；然后OptiView HRP multimer再孵育12 min；蘇木素染色4 min、藍(lán)化、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片。

1.2.2免疫組化染色判斷標(biāo)準(zhǔn) 陰性(-)：腫瘤細(xì)胞胞漿無著色；弱陽性(+)：腫瘤細(xì)胞胞漿呈淡黃色；中等陽性()：腫瘤細(xì)胞胞漿呈黃色；強(qiáng)陽性()：腫瘤細(xì)胞胞漿呈棕褐色[16]。

1.3 DNA提取

選取與免疫組化同一個(gè)石蠟包埋標(biāo)本8 μm厚切片5張，根據(jù)DNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司，貨號(hào)DP305)說明書提取基因組DNA。

1.4 ARMS法檢測(cè)BRAF V600E基因突變

加入DNA模板的量及反應(yīng)條件均按人BRAF突變檢測(cè)試劑盒(上海源奇生物科技有限公司，貨號(hào)CB300026M)說明書要求，最終反應(yīng)結(jié)果按其提供的判斷標(biāo)準(zhǔn)確定標(biāo)本BRAF基因突變狀態(tài)。

1.5 Sanger測(cè)序檢測(cè)BRAF V600E基因突變

檢測(cè)用引物序列如下，F(xiàn):5′-TCATCCTAACA-CATTTCAAGCC-3′,R:5′-GTAAAACGACGGC-CAGTTTTGTGAATACTGGGAACTATGAAA-3′。DNA擴(kuò)增以及測(cè)序按照BRAF V600E基因突變檢測(cè)試劑盒(上海源奇生物科技有限公司，貨號(hào)CB-300026M)說明書進(jìn)行操作。應(yīng)用ABI3500Dx配套的軟件系統(tǒng)Sequencing 5.4分析測(cè)序的結(jié)果，與BRAF V600E基因組DNA序列(HGNC:1097)進(jìn)行對(duì)比，確定有無突變。

2 結(jié) 果

2.1 最佳抗原修復(fù)時(shí)間

本研究4例經(jīng)Sanger測(cè)序證實(shí)V600E狀態(tài)的標(biāo)本，在24、32、40、48、56和64 min的抗原修復(fù)時(shí)間下用全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行染色。結(jié)果顯示，修復(fù)時(shí)間32 min時(shí)，染色效果最好，定位準(zhǔn)確，非特異性著色少見(圖1A～L)。

2.2 免疫組化及ARMS法檢測(cè)BRAF V600E結(jié)果的比較

免疫組化結(jié)果示，116例結(jié)直腸癌組織中，4例BRAF V600E蛋白陽性表達(dá)，其中強(qiáng)陽性1例，中等陽性2例，弱陽性1例；陰性表達(dá)112例(圖2A～D)。ARMS方法檢測(cè)的結(jié)果顯示，3例為BRAF V600E突變型，該3例標(biāo)本免疫組化檢測(cè)顯示為中等陽性以及強(qiáng)陽性，而免疫組化為弱陽性的標(biāo)本，ARMS檢測(cè)為BRAF野生型。免疫組化陰性的標(biāo)本，ARMS法也均為陰性。將4例免疫組化陽性的標(biāo)本用Sanger測(cè)序法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與ARMS檢測(cè)結(jié)果相同，即免疫組化弱陽性表達(dá)的組織證實(shí)為野生型，其余3例為V600E突變型。與基因檢測(cè)法比較，結(jié)直腸癌中BRAF V600E免疫組化法診斷的靈敏度為100%(3/3)，診斷特異度為99.1%(112/113)，陽性預(yù)測(cè)值為75%(3/4)，陰性預(yù)測(cè)值為100%(112/112)。兩種方法檢測(cè)結(jié)果的一致性為99.1%(115/116)。

3 討 論

目前檢測(cè)BRAF基因突變最常用的檢測(cè)方法是ARMS-PCR法和Sanger測(cè)序法等[18]。由于分子檢測(cè)需要提取腫瘤組織的DNA，不僅成本高，而且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，更需要專門的實(shí)驗(yàn)室、專業(yè)儀器及嚴(yán)格的質(zhì)量控制[10-19]。相比于以上方法，免疫組化技術(shù)具有穩(wěn)定、快速、敏感、易于質(zhì)控等優(yōu)勢(shì)，因此利用免疫組化對(duì)BRAF基因突變進(jìn)行檢測(cè)具有良好的應(yīng)用前景[20-21]。

本實(shí)驗(yàn)用全自動(dòng)免疫組化染色儀探討結(jié)直腸癌組織最佳的BRAF VE1抗體免疫組化染色條件，然后對(duì)116例結(jié)直腸癌組織進(jìn)行BRAF免疫組化染色和分子檢測(cè)，評(píng)估免疫組化診斷的靈敏度的和特異度。結(jié)果顯示VE1抗體檢測(cè)BRAF V600E基因突變最適宜的抗原修復(fù)時(shí)間為32 min。在此條件下對(duì)結(jié)直腸癌組織進(jìn)行BRAF V600E免疫組化檢測(cè)，其診斷的靈敏度可達(dá)100%，特異度達(dá)99.1%，免疫組化和分子檢測(cè)一致性高達(dá)99.1%。而且，國外研究顯示，單純手工染色，也能使免疫組化獲得良好的表達(dá)效果[16]。因此，在沒有分子實(shí)驗(yàn)室的基層病理科，只要嚴(yán)格控制免疫組化的條件，免疫組化可以作為初步篩查BRAF V600E的良好手段。

A～F:24、32、40、48、56和64 min修復(fù)時(shí)間時(shí)結(jié)直腸癌BRAF V600E突變型標(biāo)本免疫組化染色情況；G～L:24、32、40、48、56和64 min修復(fù)時(shí)間時(shí)結(jié)直腸癌BRAF V600E野生型標(biāo)本免疫組化染色情況。免疫組化染色法，200倍。

圖1不同抗原修復(fù)時(shí)間結(jié)直腸癌BRAFV600E標(biāo)本免疫組化染色情況

A:陰性染色標(biāo)本；B:弱陽性染色標(biāo)本；C:中等陽性染色標(biāo)本；D:強(qiáng)陽性染色標(biāo)本。免疫組化染色法，200倍。

研究表明，BRAF免疫組化需要嚴(yán)格的組織前處理?xiàng)l件和染色條件，如固定劑、固定時(shí)間和抗原修復(fù)液的pH值[16,22-23]。有研究證實(shí)，VE1抗體修復(fù)液最適合的pH值為8.0[16,24]。但是對(duì)于抗原修復(fù)的時(shí)間，還沒有明確研究報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，Benchmark XT全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行腸癌組織BRAF染色最佳的修復(fù)時(shí)間是32 min，低于我們科室甲狀腺乳頭狀癌的修復(fù)時(shí)間(64 min)。如果應(yīng)用甲狀腺乳頭狀癌組織的免疫組化程序(抗原修復(fù)64 min)對(duì)腸癌組織進(jìn)行染色，其非特異性著色會(huì)增加。來自南方醫(yī)科大學(xué)的研究顯示，腸癌組織抗原修復(fù)時(shí)間長于甲狀腺癌組織[25]，與我們的結(jié)論不一致，這可能和組織的前處理、不同的抗原修復(fù)條件及抗體濃度等有關(guān)。但該報(bào)道顯示免疫組化法檢測(cè)BRAF V600E的特異度低，僅為62.9%，我們推測(cè)可能和修復(fù)時(shí)間過長導(dǎo)致非特異性著色增加有關(guān)。相關(guān)研究顯示，加熱可以促進(jìn)抗原暴露抗原決定簇[22,26]。在偏中性及酸性環(huán)境中，暴露的多肽冷卻后更易折疊而隱藏抗原決定簇，在弱堿性環(huán)境中暴露的多肽帶負(fù)電荷而阻止抗原決定簇的折疊。因此弱堿性條件有利于BRAF蛋白的修復(fù)。相比于甲狀腺，腸組織有著偏堿性的外周環(huán)境，這可以在一定程度上解釋為什么腸組織相比于甲狀腺需要更少的抗原修復(fù)時(shí)間。但是在黏液腺癌中，可能是堿性太強(qiáng)，細(xì)胞核的非特異性著色依然存在，KUAN等[16]的研究也顯示，過堿性(pH 9.0)的修復(fù)液也會(huì)導(dǎo)致非特異性著色。但是非特異性著色的具體原因仍需要更深入的探討。

免疫組化應(yīng)用于臨床之前需要嚴(yán)格而準(zhǔn)確的評(píng)分系統(tǒng)。大部分研究都采用強(qiáng)陽性()、中等陽性()、弱陽性(+)及陰性(-)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[24,27-28]，但是也有研究以陽性腫瘤細(xì)胞百分率作為評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)[29-30]。我們認(rèn)為，由于評(píng)判結(jié)果難以統(tǒng)一，按照陽性腫瘤細(xì)胞百分率作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)的方法并不太適合于臨床病理診斷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫組化中強(qiáng)陽性的標(biāo)本，PCR陽性，免疫組化陰性的標(biāo)本，PCR也陰性，只有1例弱陽性的標(biāo)本結(jié)果與PCR不符。因此，4個(gè)等級(jí)的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)是更合適的。但是弱陽性標(biāo)本需要進(jìn)行分子檢測(cè)以排除假陽性。

綜上所述，我們認(rèn)為，在嚴(yán)格控制免疫組化染色條件的前提下，VE1抗體檢測(cè)BRAF V600E與基因檢測(cè)方法具有很高的一致性。對(duì)于不具備分子檢測(cè)的臨床病理科室來說，免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法是BRAF V600E檢測(cè)的一種有效篩查手段，值得推廣。對(duì)于免疫組化弱陽性的標(biāo)本，需要進(jìn)行基因檢測(cè)以排除假陽性。

[1] THIEL A, RISTIMAKI A. Toward a molecular classification of colorectal cancer:The role of braf[J]. Front Oncol, 2013,3(384):281.

[2] AKABANE H, SULLIVAN R J. The future of molecular analysis in melanoma: Diagnostics to direct molecularly targeted therapy[J]. Am J Clin Dermatol, 2015,17(1):1-10.

[3] VAUGHN C P, ZOBELL S D, FURTADO L V, et al. Frequency of kras, braf, and nras mutations in colorectal cancer[J]. Gene Chromosome Canc, 2011,50(5):307-312.

[4] 朱曉麗,蔡旭,張玲,等. 中國結(jié)直腸癌患者中kras與braf基因突變特征及其臨床病理相關(guān)性[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2012,41(9):584-589.

[5] LOUGHREY M B, WARING P M, TAN A, et al. Incorporation of somatic braf mutation testing into an algorithm for the investigation of hereditary non-polyposis colorectal cancer[J]. Fam Cancer, 2007,6(3):301-310.

[6] 高玲,陳新華,郭志娟. Braf基因突變?cè)诮Y(jié)直腸癌診治中的研究進(jìn)展[J]. 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘, 2017(95):44-45.

[7] VAN CUTSEM E, KOHNE C H, LANG I, et al. Cetuximab plus irinotecan, fluorouracil, and leucovorin as first-line treatment for metastatic colorectal cancer: Updated analysis of overall survival according to tumor kras and braf mutation status[J]. J Clin Oncol, 2011,29(15):2011-2019.

[8] 阿茹娜. 對(duì)于ⅱ期及ⅲ期微衛(wèi)星不穩(wěn)定結(jié)腸癌患者braf和kras突變狀態(tài)的預(yù)后價(jià)值[J]. 中國普外基礎(chǔ)與臨床雜志, 2016(7):837-837.

[9] DE ROOCK W, CLAES B, BERNASCONI D, et al. Effects of kras, braf, nras, and pik3ca mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: A retrospective consortium analysis[J]. Lancet Oncol, 2010,11(8):753-762.

[10] PAI R K, JAYACHANDRAN P, KOONG A C, et al. Braf-mutated, microsatellite-stable adenocarcinoma of the proximal colon: An aggressive adenocarcinoma with poor survival, mucinous differentiation, and adverse morphologic feature[J]. Am J Surg Pathol, 2012,36(5):744-752.

[11] 李森朋,張岫美,張芮. Braf基因突變與腫瘤耐藥[J]. 藥學(xué)研究, 2013,32(8):470-472.

[12] ILIE M I, LASSALLE S, LONG-MIRA E, et al. Diagnostic value of immunohistochemistry for the detection of the braf v600e mutation in papillary thyroid carcinoma: Comparative analysis with three DNA-based assays[J]. Thyroid, 2014,24(5):858-866.

[13] LONG G V, WILMOTT J S, CAPPER D, et al. Immunohistochemistry is highly sensitive and specific for the detection of v600e braf mutation in melanoma[J]. Am J Surg Pathol, 2013,37(1):61-65.

[14] 呂矯潔,孔蘊(yùn)毅,蔡旭,等. Braf v600e抗體在檢測(cè)惡性黑色素瘤braf v600e基因突變中的應(yīng)用價(jià)值[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2017,46(8):548-552.

[15] ADACKAPARA C A, SHOLL L M, BARLETTA J A, et al. Immunohistochemistry using the braf v600e mutation-specific monoclonal antibody ve1 is not a useful surrogate for genotyping in colorectal adenocarcinoma[J]. Histopathology, 2013,63(2):187-193.

[16] KUAN S F, NAVINA S, CRESSMAN K L, et al. Immunohistochemical detection of braf v600e mutant protein using the ve1 antibody in colorectal carcinoma is highly concordant with molecular testing but requires rigorous antibody optimization[J]. Hum Pathol, 2014,45(3):464-472.

[17] BLEDSOE J R, KAMIONEK M, MINO-KENUDSON M. Braf v600e immunohistochemistry is reliable in primary and metastatic colorectal carcinoma regardless of treatment status and shows high intratumoral homogeneity[J]. Am J Surg Pathol, 2014,38(10):1418-1428.

[18] 張旭東,陳瑞雪,王潔. Braf基因突變與腫瘤[J]. 中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào), 2017(5):668-674.

[19] ABD ELMAGEED Z Y, SHOLL A B, TSUMAGARI K, et al. Immunohistochemistry as an accurate tool for evaluating braf-v600e mutation in 130 samples of papillary thyroid cancer[J]. Surgery, 2017,161(4):1122-1128.

[20] ANNE-KATRIN ZIMMERMANN M D, CAMENISCH U, RECHSTEINER M P, et al. Value of immunohistochemistry in the detection of brafv600e mutations in fine-needle aspiration biopsies of papillary thyroid carcinoma[J]. Cancer Cytopathol, 2014,122(1):48-58.

[21] NA J I, KIM J H, KIM H J, et al. Ve1 immunohistochemical detection of the braf v600e mutation in thyroid carcinoma: A review of its usefulness and limitations[J].

Virchows Archiv, 2015,467(2):155-168.

[22] DVORAK K, AGGELER B, PALTING J, et al. Immunohistochemistry with the anti-braf v600e (ve1) antibody: Impact of pre-analytical conditions and concordance with DNA sequencing in colorectal and papillary thyroid carcinoma[J]. Pathology, 2014,46(6):509-517.

[23] AFFOLTER K, SAMOWITZ W, TRIPP S, et al. Braf v600e mutation detection by immunohistochemistry in colorectal carcinoma[J]. Gene Chromosome Canc 2013,52(8):748-752.

[24] SINICROPE F A, SMYRK T C, TOUGERON D, et al. Mutation-specific antibody detects mutant brafv600e protein expression in human colon carcinomas[J]. Cancer, 2013,119(15):2765-2770.

[25] 時(shí)姍姍,王璇,夏秋媛,等. Braf ve1抗體在結(jié)直腸癌中檢測(cè)braf v600e突變的應(yīng)用[J]. 臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志, 2016,32(12):1383-1385.

[26] EMOTO K, YAMASHITA S, OKADA Y.Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: Does ph or ionic strength of the solution play a role for refolding antigens[J]. J Histochem Cytochem, 2005,53(11):1311-1321.

[27] ZAGZAG J, POLLACK A, DULTZ L, et al. Clinical utility of immunohistochemistry for the detection of the braf v600e mutation in papillary thyroid carcinoma[J]. Surgery, 2013,154(6):1199-1204

[28] ZHU X, LUO Y, BAI Q, et al. Specific immunohistochemical detection of the braf v600e mutation in primary and metastatic papillary thyroid carcinoma[J]. Exp Mol Pathol, 2016,100(1):236-241.

[29] TOON C W, WALSH M D, CHOU A, et al. Brafv600e immunohistochemistry facilitates universal screening of colorectal cancers for lynch syndrome[J]. Am J Surg Pathol, 2013,37(10):1592-1602.

[30] CAPPER D, VOIGT A, BOZUKOVA G, et al. Braf v600e-specific immunohistochemistry for the exclusion of lynch syndrome in msi-h colorectal cancer[J]. Int J Cancer, 2013,133(7):1624-1630.