張召興，肖麗榮，李巧玲，李蘊玉，李佩國，吉志新，岳香云，賈青輝，史秋梅

(河北科技師范學(xué)院/河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北秦皇島 066604)

大腸桿菌病是由某些致病性大腸埃希菌(Escherichiacoli，E.coli)菌株引起多種動物及人不同疾病的總稱，大腸埃希菌廣泛存在自然界中，可以感染豬、雞、狐貍、貉、貂等多種動物，引發(fā)不同的癥狀，是一種人畜共患重要的條件致病菌[1-2]。狐貍致病性大腸埃希菌主要感染斷奶前后的幼獸，多呈暴發(fā)流行并有一定的季節(jié)性，臨床以敗血癥和腹瀉為主，感染率和病死率均較高，還侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)，成年和老年的狐貍很少發(fā)病，成年母狐感染致病性大腸埃希菌會引起流產(chǎn)和死胎，造成嚴重的經(jīng)濟損失[3]。

近年來，在養(yǎng)殖過程中抗菌藥物的不合理使用，導(dǎo)致了致病性大腸埃希菌產(chǎn)生很強的耐藥性，是許多敏感的抗菌藥物變?yōu)椴幻舾谢蚨嘀啬退?，并且?dǎo)致大量的抗菌藥物在動物體內(nèi)的殘留，給人類的健康造成嚴重的危害[4-6]。中草藥富含有多種化學(xué)成分，不僅具有抗菌、增強免疫力、抗炎、抗內(nèi)毒素多種藥理作用，還具有無副作用、低殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等多種優(yōu)點[7]。中草藥藥理作用復(fù)雜，對動物機體具有雙向調(diào)節(jié)作用，通過多個途徑調(diào)解機體的功能狀態(tài)[8]。中草藥在防治畜禽疾病中被廣泛應(yīng)用，因此，本研究通過測定26味中草藥對狐貍E.coliHL2(O1)地方菌株的體外抑菌活性，為進一步研發(fā)防治狐貍致病性大腸桿菌病復(fù)方中草藥制劑及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 狐貍致病性E.coliHL2(O1)地方株及標準菌株ATCC25922，由河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 五味子、訶子、金銀花、黃連等26味單味中草藥，購自秦皇島民樂醫(yī)藥有限公司; 普通培養(yǎng)培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯，北京奧星生物技術(shù)公司產(chǎn)品；96孔細菌培養(yǎng)板，美國Corning公司產(chǎn)品；10 g/L紅四氮唑，美國Corning公司產(chǎn)品；普通粉碎機，青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限責(zé)任公司產(chǎn)品；YT-CJ-1D型超凈工作臺，北京亞泰科隆儀器技術(shù)有限公司產(chǎn)品;GHP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;常規(guī)試劑及儀器，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室提供。

1.2 材料

1.2.1 單味中草藥藥液的制備 參照文獻[9]的方法，用水提法制備的中草藥藥液，取26味中草藥，用普通粉碎機粉碎后稱量50 g，加入5倍～0倍的蒸餾水浸泡1 h～1.5 h，煮開后用文火再煎煮30 min，用12層紗布過濾，再加入5倍蒸餾水煮沸，用文火再煎煮20 min過濾藥液。將兩次所煮藥液合并進行濃縮為每毫升含原藥為1 g。離心后并調(diào)整其pH為7.2～7.4之間，分裝，121℃滅菌10 min,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌液的制備與計數(shù) 將HL2(O1)地方株與標準菌株ATCC25922的菌種接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，將接種好的培養(yǎng)基置于37℃的恒溫箱中培養(yǎng)12 h，挑取單菌落接種于肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃振蕩培養(yǎng)，每隔2 h用分光光度計在600 nm測其OD值，確定細菌的對數(shù)期，利用平板計數(shù)法進行菌落計數(shù)，調(diào)整菌液濃度108CFU/mL。

1.2.3 單味中草藥體外抑菌圈直徑的測定 參照文獻[7]的方法，用平板打孔法測定26種單味中草藥抑菌圈直徑，取對數(shù)期的菌液0.1 mL(108CFU/mL)均勻涂布在平板上，待完全吸收后用直徑6 mm的打孔器打孔，并加滿中草藥藥液，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h～16 h，每種藥物3個重復(fù)，取平均值；判定標準為：10 mm<抑菌直徑為低敏；10 mm≤抑菌直徑<15 mm為中敏；15 mm≤抑菌直徑<20 mm為高敏；20 mm≤抑菌直徑為極敏。

1.2.4 單味中草藥MBC的測定 參照文獻[8]的方法，采用改良微量二倍法測定26種單味中草藥的最低殺菌濃度(minimum bactericidal concentration,MBC)。用96孔細菌培養(yǎng)板，第1～10孔加入100 μL滅菌水，在第1孔中加入100 μL中草藥藥液混勻后取100 μL加入到第3孔中，以此類推到10孔，在第3孔混勻后取100 μL混合液加入第4孔，以此類推，到第9孔混勻后棄去100 μL。在第1～11孔中分別加入100 μL 2×NB，第10孔不加藥做為陽性對照孔，第11孔不接菌做為陰性對照孔。在第1～10孔接種10 μL(108CFU/mL)對數(shù)期的菌液，每種藥物3個重復(fù)，每孔分別加入5 μL紅四氮唑(10 g/L)，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，若顏色變紅則說明有細菌生長。用無菌棉簽分區(qū)劃線法，無菌生長的區(qū)域則為各中藥的MBC。

2 結(jié)果

2.1 單味中草藥抑菌圈直徑測定結(jié)果

由表1可知，狐貍致病性E.coliHL2(O1)地方菌株對五味子、訶子2種藥物為極度敏感；對金銀花、黃連、苦參3種藥物高度敏感；對板藍根、黃芩、五倍子等10種藥物中度敏感；對地丁、白頭翁、連翹、穿心蓮4種藥物低度敏感，對女貞子、蒲公英、大青葉等7種藥物不敏感。

表1 中藥對狐貍致病性E.coli HL2(O1)地方株體外抑菌試驗

注：-.無效果。

Note：-.No effect.

2.2 單味中草藥MBC結(jié)果

由表2可知該菌對五味子、訶子、金銀花3種藥物的MBC在7.825 mg/mL～15.65 mg/mL之間；對黃連、五倍子、苦參3種藥物的MBC在15.65 mg/mL～31.25 mg/mL之間；對五倍子、苦參2種藥物的MBC在31.25 mg/mL；對黃芩、板藍根、沙棘5種藥物的MBC在62.5 mg/mL～125 mg/mL之間；對白頭翁、黃柏、馬齒莧5種藥物的MBC在125 mg/mL～250 mg/mL之間；對夏枯草、連翹、穿心蓮3種藥物的MBC在250 mg/mL～500 mg/mL之間。女貞子、蒲公英、大青葉等7種藥物對該菌則無效果。

表2 中藥對狐貍致病性E.coli HL2(O1)地方菌株的MBC

注：-.無效果。

Note：-.No effect.

3 討論

致病性大腸埃希菌可以引發(fā)多種動物及人發(fā)病，不同動物感染致病性大腸埃希菌引起不同的病癥，尤其對幼齡動物比較易感，該菌血清型比較多，因地區(qū)而異致病力也有所不同，大腸桿菌病已經(jīng)成為了危害健康養(yǎng)殖的主要傳染病之一[1]。在養(yǎng)殖過程中，臨床大多采用抗菌藥物進行防治致病性大腸埃希菌，由于抗菌藥物大量不合理使用，不僅會破壞動物腸道先天免疫力，引起腸道內(nèi)菌群失調(diào)，還容易形成耐藥菌株，同時也造成大量的藥物殘留[10-11]。 中草藥中富含多種化學(xué)物質(zhì)，這些性物質(zhì)在動物體內(nèi)不僅對病原菌有直接或者間接殺滅作用以及消除病原菌的耐藥性，還可以調(diào)節(jié)整個動物機體免疫系統(tǒng)，提高機體免疫力，具有雙向調(diào)節(jié)作用[12]。相關(guān)文獻報道了中草藥可以中和病原菌在動物產(chǎn)生的內(nèi)毒素，促進動物機體毒素的排泄[13]。許多研究證實中草藥的不同成分對致病性大腸埃希菌具有很好的抑菌效果。馮亞凈等[14]報道了五味子中的木脂素對大腸埃希菌的抑菌效果。胡立磊等[15]研究表明，金銀花提取物對大腸埃希菌具有很好的抑菌作用。徐倩倩等[16]報道了白頭翁湯方劑及其單味藥水提取液對豬、雞大腸埃希菌具有很好抑菌效果。

本研究采用平板打孔法和改良微量二倍稀釋法測定26味單味中草藥對狐源致病性E.coliHL2(O1)地方流行株的體外抑菌活性，結(jié)果顯示，五味子、訶子對狐源致病性大腸埃希菌呈極度敏感，抑菌圈直徑在21.3 mm～20.3 mm之間，MBC均為7.825 mg/mL；金銀花、黃連、苦參3種藥物高度敏感，抑菌圈直徑在16.4 mm～19.3 mm之間，MBC在15.65 mg/mL～31.25 mg/mL；對板藍根、黃芩、五倍子等10種藥物中度敏感；張慧等[17]報道了金銀花、黃連對禽類大腸埃希菌抑菌效果最好。向雙云等[18]報道魚腥草、艾葉、五味子對大腸埃希菌K88高度敏感，與本試驗結(jié)果存在一定的差異性，其原因可能與中草藥制備工藝、所分離菌株的地區(qū)不同，感染的宿主動物等有關(guān)。由于中草藥成分復(fù)雜，需要進一步研究中草藥對致病性E.coli作用機理。本試驗通過測定26味單味中草藥對狐源致病性E.coliHL2(O1)地方流行株的體外抑菌活性，國內(nèi)尚未見報道。本研究進一步研發(fā)防治狐貍大腸桿菌病復(fù)方中草藥制劑及臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

[1] 陳溥言.獸醫(yī)傳染病學(xué)[M].6版.北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,2015.

[2] 張召興,李蘊玉,張艷英,等.秦皇島地區(qū)貉源E.coli的分離鑒定與耐藥性分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2016(6下)：121-122.

[3] 馬澤芳,崔 凱,高志光.毛皮動物飼養(yǎng)與疾病防制[M].北京:金盾出版社,2013.

[4] 毛福超,郁 川,韓 璐,等.豫西地區(qū)禽源大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性分析[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,45(1):127-130.

[5] 教郁,高維凡,胡彩光.大腸桿菌耐藥性研究進展[J].現(xiàn)代畜牧獸醫(yī),2013(5):53-58．

[6] Stannarius C，Burgi E，Regula G，et al.Antimicrobial resistance inEscherichiacolistrains isolated from Swiss weaned pigs and sows[J].Schweiz Arch Tierheilkd,2009,151(3):119-125．

[7] 張召興,李蘊玉,常超越,等.中藥對雞致病性大腸埃希菌的體外抑菌試驗[J].動物醫(yī)學(xué)進展,2017,38(3):63-67.

[8] 張賽奇,王 米,蕾 娜,等.中藥對豬源大腸桿菌O8體外抑菌試驗研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報,2015,36(8):62-65.

[9] 李蘊玉,張召興,賈 青,等.單味中草藥對雞致病性綠膿桿菌體外抑菌試驗[J].中國獸醫(yī)雜志,2017,53(2):52-54.

[10] Haenni M,Chate P,Metayer V,et al.Comparative prevalence and characterization of ESBL producing Enterobacteriaceae in dominant verus subdominant enteric flora in veal calves at slaughterhouse,Francn[J].Vet Microbiol,2014,171(3-4):321-327.

[11] 夏利寧,高 娟,蘇戰(zhàn)強,等.新疆克拉瑪依莫豬場不同生長期豬源大腸桿菌耐藥性調(diào)查[J].家畜生態(tài)學(xué)報,2015,36(9):69-72.

[12] 程 銳,鄒佳妤,李子佳,等.中獸醫(yī)藥防治雞大腸桿菌病應(yīng)用[J].中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志,2014(6):75-76.

[13] 靳雙星,張桂枝.復(fù)方中藥合劑對AA 肉仔雞脾臟和法氏囊結(jié)構(gòu)及發(fā)育的影響[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2014,45(4):1-5.

[14] 馮亞凈,張媛媛,王瑞鑫,等.五味子木脂素對大腸桿菌的抑菌機理及效果[J].食品發(fā)酵業(yè),2016,42(2):72-76.

[15] 胡立磊,郭永剛,樊克鋒.金銀花提取物對大腸桿菌體外抑菌試驗[J].中獸醫(yī)學(xué)雜志,2016(5):22-23.

[16] 徐倩倩，郭時金,王艷萍,等.白頭翁湯方及其單味藥水提取液對豬、雞大腸桿菌體外抑菌活性的測定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2016(6):185-187,191.

[17] 張 慧,秦志華,鄒 明,等.抗禽大腸桿菌中藥的體外抑菌方法和效果的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2014,26(3):598-602．

[18] 向雙云,周珍輝,李玉冰,等. 8種中草藥對大腸桿菌的體外抑菌試驗[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2016(5下):167-169.