孫紅煒， 李 凡， 高 瑞， 徐曉輝， 楊淑珂， 路興波

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/山東省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250100

玉米是我國種植面積最大的糧食作物，2016年中國玉米種植面積3676萬hm2，在我國糧食及飼料工業(yè)中占有舉足輕重的作用。亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)、黏蟲Mythimnaseparata(Walker)和棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Hübner)是影響玉米產(chǎn)量的三大主要鱗翅目害蟲，在個(gè)別年份，由于害蟲的危害，甚至?xí)斐捎衩捉^收。如2012年在吉林省、2016年在陜西渭南，均發(fā)生嚴(yán)重的玉米黏蟲為害(聶繼東和汪洪偉，2017; 王紅軍和郭書亞，2017; 王振營和魯新，2010)。我國玉米害蟲防治主要依賴化學(xué)防治，化學(xué)防治雖然效果較好，但存在防治滯后、無法挽回實(shí)際損失的缺點(diǎn)。另外，化學(xué)防治不當(dāng)容易造成環(huán)境、食品污染，同時(shí)浪費(fèi)大量人力、物力。

1996年轉(zhuǎn)基因玉米在美國首次商品化，轉(zhuǎn)基因作物在全球蓬勃發(fā)展，其中轉(zhuǎn)Bt基因玉米是目前商品化生產(chǎn)發(fā)展最快的轉(zhuǎn)基因抗蟲作物之一(James，2016)。轉(zhuǎn)Bt基因玉米通過持續(xù)表達(dá)外源Bt蛋白，在整個(gè)生育期都可以對(duì)靶標(biāo)生物產(chǎn)生抑制或抗性效果，可以大大減少人力、物力的投入，且安全高效。國外應(yīng)用轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米已超過20年，對(duì)靶標(biāo)害蟲表現(xiàn)了良好的抗性(Burknessetal.，2001; Lynchetal.，1999； Williamsetal.，1998)。我國轉(zhuǎn)基因玉米研發(fā)雖然起步較晚，但發(fā)展迅速，在Bt基因篩選、改造和合成方面取得很多專利成果，且有為數(shù)眾多的轉(zhuǎn)Bt基因玉米進(jìn)行到中間試驗(yàn)或環(huán)境釋放試驗(yàn)階段(王延峰，2010， 岳同卿等，2010)。轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5是浙江大學(xué)研發(fā)的含有抗蟲基因cry1Ab/cry2Aj與耐除草劑基因G10evo-epsps的轉(zhuǎn)基因玉米新品系，cry1Ab/cry2Aj對(duì)亞洲玉米螟有較高的殺蟲活性，草甘膦靶標(biāo)酶基因G10evo-epsps對(duì)草甘膦具有很高的耐受性。

轉(zhuǎn)基因作物在推廣之前，必須經(jīng)過環(huán)境安全性評(píng)價(jià)，如抗蟲性、除草劑耐受性、生存競爭能力、對(duì)農(nóng)田生物多樣性的影響等(姜偉麗等，2013; 馬小艷等，2013)。本試驗(yàn)利用ELISA法測定了轉(zhuǎn)基因玉米雙抗12-5轉(zhuǎn)育后獲得的玉米材料雙抗505-12-5中Bt蛋白在不同生育期不同組織中的Bt蛋白表達(dá)量，并對(duì)其室內(nèi)及田間抗蟲性進(jìn)行了研究，為轉(zhuǎn)基因玉米的基礎(chǔ)研究、推廣應(yīng)用以及害蟲防治方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試玉米

轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩字锌朴?05，由浙江大學(xué)提供；常規(guī)品種登海3號(hào)，購自當(dāng)?shù)胤N子市場；田間抗蟲性鑒定感蟲品種綜31由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 每種玉米材料設(shè)3次重復(fù)，小區(qū)面積300 m2(50 m×6 m)，行距60 cm，株距25 cm，小區(qū)間設(shè)2 m間隔，以防害蟲在不同小區(qū)之間擴(kuò)散。Bt蛋白含量測定、鱗翅目害蟲室外及室內(nèi)抗蟲性鑒定均在相應(yīng)的小區(qū)接蟲或取樣。

1.2.2 Bt蛋白表達(dá)量檢測樣品采集及前期處理 在轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5的6～8葉期、大喇叭口期、吐絲期、乳熟期取根、莖、心葉，吐絲期取花絲，乳熟期取幼嫩籽粒。每小區(qū)5點(diǎn)取樣，每點(diǎn)選取2株生長一致的玉米植株，每個(gè)小區(qū)采集10株玉米，按不同部位分類采集樣品，同一小區(qū)同一部位樣品剪碎混合，-80 ℃低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 Bt蛋白的測定 采用Cry1Ab/Ac酶聯(lián)免疫定量檢測試劑盒(上海佑隆公司,貨號(hào)：AA0341)測定樣品Bt蛋白含量，按照說明書操作并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品吸光度值由酶標(biāo)儀(bio-rad iMark microplate reader)讀取，記錄D450 nm吸光度。

1.3 轉(zhuǎn)基因玉米室內(nèi)抗蟲性鑒定

亞洲玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲均由本研究室人工繁殖，處理組為轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5，對(duì)照組為非轉(zhuǎn)基因玉米中科玉505。玉米螟在6～8葉期、花絲期、籽粒期采集相應(yīng)幼嫩部位飼喂；黏蟲在4～6葉期，棉鈴蟲在花絲期采集相應(yīng)幼嫩部位飼喂。飼喂容器均采用6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔10頭初孵幼蟲，每板為一個(gè)重復(fù)，4次重復(fù)。所有處理每24 h更換相同來源的新組織，并記錄活蟲數(shù)，按以下公式計(jì)算校正死亡率。

校正死亡率/%=(處理組死亡率-對(duì)照組死亡率)/(100-對(duì)照組死亡率)×100

1.4 田間抗蟲性鑒定

1.4.1 亞洲玉米螟 在玉米心葉期(6～8葉期)和吐絲期人工接種初孵幼蟲，選擇傍晚接蟲。心葉期接種到心葉內(nèi)，吐絲期接種到花絲上。每小區(qū)人工定株接蟲40株，每株接蟲30～40頭。間隔3 d后進(jìn)行第2次接蟲，最后一次接蟲14 d后調(diào)查。

心葉期調(diào)查：調(diào)查接蟲株中上部葉片被玉米螟危害程度，包括受害葉片上的蟲孔大小、數(shù)量及分布等，計(jì)算平均食葉級(jí)別，根據(jù)平均食葉級(jí)別判定玉米心葉期對(duì)玉米螟的抗性水平。危害程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部(2006)。

吐絲期調(diào)查：根據(jù)雌穗被害情況、蛀孔數(shù)量、隧道長度及存活幼蟲齡期、數(shù)量等，計(jì)算各小區(qū)雌穗被害級(jí)別平均值，判定玉米穗期對(duì)玉米螟的抗性水平。雌穗被害級(jí)別分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部(2007)。

1.4.2 黏蟲 4～6葉期接蟲，接蟲方法及接蟲次數(shù)同玉米螟。最后一次接蟲后14 d調(diào)查玉米葉片被害程度及黏蟲幼蟲存活數(shù)，記錄心葉被害級(jí)別并計(jì)算被害級(jí)別平均值，判定玉米心葉期對(duì)黏蟲的抗性水平。被害程度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部(2007)。

1.4.3 棉鈴蟲 吐絲期接蟲，接蟲方法及接蟲次數(shù)同玉米螟。最后一次接蟲后14 d調(diào)查雌穗被害率、幼蟲存活數(shù)、雌穗被害長度，確定雌穗被害級(jí)別并計(jì)算平均值，判定玉米對(duì)棉鈴蟲的抗性水平。雌穗被害級(jí)別分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部(2007)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5中Bt蛋白的時(shí)空表達(dá)

2.1.1 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5根、莖及葉片中Bt蛋白的時(shí)空表達(dá) 由圖1看出，根、莖、葉3種器官中，6～8葉期至吐絲期，Bt蛋白含量逐漸降低，乳熟期略有回升。6～8葉期，Bt蛋白含量最高，其中根部最高(517.3 ng·g-1)，其次為心葉(453.8 ng·g-1)，莖中表達(dá)量最低；大喇叭口期，根、莖、心葉中Bt蛋白含量均較6～8葉期降低，心葉中Bt蛋白含量最高(353.3 ng·g-1)，根中Bt蛋白降幅最大，為281.3 ng·g-1，總體表現(xiàn)為心葉>根>莖；吐絲期，根、莖、心葉中Bt蛋白含量繼續(xù)降低，仍然表現(xiàn)為心葉>根>莖；乳熟期，心葉Bt蛋白含量和吐絲期相比略有下降，為185.4 ng·g-1，根、莖中Bt蛋白上升，三者Bt蛋白含量相當(dāng)，在160～190 ng·g-1之間，差異不顯著。6～8葉期是亞洲玉米螟的第一次發(fā)生高峰，第一代幼蟲均集中在心葉內(nèi)取食，因此，6～8葉期Bt蛋白表達(dá)量高低是決定轉(zhuǎn)基因玉米后期能否推廣的關(guān)鍵。從研究結(jié)果看，6～8葉期心葉Bt蛋白表達(dá)量高達(dá)453.8 ng·g-1，對(duì)于防止亞洲玉米螟幼蟲侵害具有重要作用。

圖1 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5不同生育期根、莖、葉片中Bt蛋白含量Fig.1 Bt protein content of double-resistant 505-12-5 transgenic maize in root, stem and leaf at different growth stages

2.1.2 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5中Bt蛋白在繁殖器官中的表達(dá) 由圖2可以看出，轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5繁殖器官中Bt蛋白含量比其他組織中含量低，不同繁殖器官Bt蛋白含量有差異，幼籽Bt蛋白含量最高(181.3 ng·g-1)，其他依次是花絲、花粉、雄穗，分別為100.1、95.0、79.8 ng·g-1。從吐絲期繁殖器官Bt蛋白含量看，籽粒和花絲中Bt蛋白含量較高，有助于抵御亞洲玉米螟幼蟲的侵害，可以有效減少入侵幼穗的亞洲玉米螟數(shù)量，從而保護(hù)幼穗，減少產(chǎn)量損失。

圖2 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5繁殖器官中Bt蛋白含量Fig.2 Bt protein content of double-resistant 505-12-5 transgenic maize in reproductive organs

2.2 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5對(duì)3種鱗翅目害蟲的田間抗蟲性

雙抗505-12-5對(duì)3種鱗翅目害蟲田間抗性見

表1。感蟲品種綜31對(duì)3種鱗翅目害蟲抗性均為感蟲水平。對(duì)亞洲玉米螟來說，心葉期和雌穗期，雙抗505-12-5的被害級(jí)別平均值分別為2.71、1.40，均表現(xiàn)為高抗，中科玉505均表現(xiàn)為感蟲，而當(dāng)?shù)貙?duì)照登海3號(hào)在心葉期表現(xiàn)為中抗，在雌穗期表現(xiàn)為感蟲；對(duì)黏蟲來說，心葉期，雙抗505-12-5的平均食葉級(jí)值為1.97，抗性類型為高抗，中科玉505和登海3號(hào)分別為感蟲和抗性級(jí)別；對(duì)棉鈴蟲來說，雌穗期，雙抗505-12-5被害級(jí)別平均值為0.97，中科玉505和登海3號(hào)的被害級(jí)別平均值分別為5.97、5.67，均表現(xiàn)為感蟲。

總體看，轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5田間對(duì)亞洲玉米螟、黏蟲、棉鈴蟲的抗性水平均達(dá)到高抗，抗性顯著高于非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩锌朴?05及當(dāng)?shù)貙?duì)照登海3號(hào)。

表1 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5對(duì)3種鱗翅目害蟲的田間抗性Table 1 Field resistance of double-resistant 505-12-5 transgenic maize against three Lepidoptera pests

同列不同小寫字母表示差異顯著。S：感蟲， HR：高抗， MR：中抗。

Small letters within a column represent significant differences among treatments atP<0.05. S: Susceptible; HR: High resistant; MR: Moderate resistant.

2.3 轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5對(duì)3種鱗翅目害蟲的室內(nèi)抗蟲性

6～8葉期，用雙抗505-12-5幼嫩葉片飼喂亞洲玉米螟幼蟲24 h后，校正死亡率為87.37%，48 h后達(dá)到100%；花絲期和乳熟期，接蟲后24 h，亞洲玉米螟幼蟲校正死亡率均達(dá)到100%。研究表明，轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5在心葉期、花絲期和乳熟期均對(duì)亞洲玉米螟表現(xiàn)出明顯的抗蟲效果。

4～6葉期，雙抗505-12-5對(duì)黏蟲的抗性起效較慢，接蟲后24 h，黏蟲校正死亡率僅為10.17%，但接蟲后48 h，校正死亡率達(dá)到98.21%，表明雙抗505-12-5室內(nèi)對(duì)黏蟲同樣具有較好的抗性。

花絲期，用雙抗505-12-5花絲飼喂棉鈴蟲幼蟲24 h后，棉鈴蟲幼蟲校正死亡率達(dá)到80.18%，48 h后校正死亡率為92.45%，表明雙抗505-12-5室內(nèi)對(duì)棉鈴蟲也表現(xiàn)出較好的抗性。

3 討論

轉(zhuǎn)Bt基因玉米在美國、巴西等部分拉美國家已經(jīng)得到大面積推廣，轉(zhuǎn)基因玉米占種植玉米總面積的80%以上，常見的轉(zhuǎn)Bt基因玉米有MON810、Bt176、Bt11等。抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米外源殺蟲蛋白的表達(dá)量高低與玉米的殺蟲效果有直接的關(guān)系。本試驗(yàn)中，心葉期根部Bt蛋白的含量最高，高于心葉等其他器官，但與心葉表達(dá)量相差僅為70 ng·g-1，這與其他報(bào)道心葉含量最高略有差異(姜志磊等，2008， 史曉利等，2009; 王建武等，2003)。隨著植株生長，到大喇叭口期，各器官表達(dá)量尤其根部Bt蛋白的含量顯著下降，心葉中的Bt蛋白表達(dá)量最高；吐絲期各器官Bt蛋白表達(dá)量持續(xù)降低，發(fā)育后期繁殖器官Bt蛋白表達(dá)量低于其他生育期各器官?？傮w來看，Bt蛋白表達(dá)量表現(xiàn)出隨著生育期延長而逐漸降低的趨勢(shì)，不同器官在不同生育期Bt蛋白的表達(dá)量也不同(王冬妍等，2004; 王建武等，2003)，國外主要抗蟲品種MON810 Bt蛋白時(shí)空表達(dá)的研究也顯示了類似的結(jié)果(Székácsetal.，2010)。Bt蛋白的表達(dá)量除了與轉(zhuǎn)基因調(diào)控元件有關(guān)外，與玉米品種、生長環(huán)境、播種時(shí)間也有關(guān)系。同一玉米品種播期不同，Bt蛋白表達(dá)量也有差異，如Bt11春玉米心葉比夏玉米心葉表達(dá)量低大約700 ng，而Bt-X春玉米心葉比夏玉米心葉表達(dá)量低約150 ng(王培等，2012)。另外，研究表明，Bt蛋白的表達(dá)量與溫度有關(guān)，在一定范圍內(nèi)，溫度低，蛋白表達(dá)量相對(duì)較低(路獻(xiàn)勇等，2015)。

轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米推廣前，除了測定蛋白表達(dá)量，最關(guān)鍵的是明確抗蟲效果。國外推廣品種經(jīng)田間及離體生測試驗(yàn)證實(shí)，均對(duì)靶標(biāo)害蟲具有顯著的抗性(常雪等，2007; Burknessetal.，2001；Lynchetal.，1999； Williamsetal.，1998)。本試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5的室內(nèi)抗蟲性鑒定結(jié)果表明，心葉期飼喂轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5后48 h，亞洲玉米螟校正死亡率達(dá)100%。常雪等(2013)用轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj基因玉米不同品系心葉飼喂亞洲玉米螟幼蟲48 h的死亡率為60%～6.8%，96 h后大部分幼蟲死亡，死亡時(shí)間較雙抗505-12-5推遲；雙抗505-12-5花絲期、乳熟期飼喂亞洲玉米螟幼蟲校正死亡率24 h即達(dá)100%，常雪等(2013)發(fā)現(xiàn)亞洲玉米螟幼蟲取食轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj基因玉米各品系雄穗、苞葉、花絲和雌穗48 h后死亡率在90%左右；雙抗505-12-5花絲期飼喂棉鈴蟲后48 h，校正死亡率為92.45%，而常雪等(2016)發(fā)現(xiàn)取食轉(zhuǎn)3個(gè)轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj玉米品系和1個(gè)轉(zhuǎn)cry1Ab/vip3DA品系Bt玉米葉片96 h后棉鈴蟲死亡率為87.50%～90.00%，死亡時(shí)間較雙抗505-12-5推遲48 h。雙抗505-12-5心葉期飼喂黏蟲，接蟲后24 h校正死亡率僅為10.17%，但48 h后即達(dá)98.21%。轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5室內(nèi)對(duì)亞洲玉米螟、棉鈴蟲、黏蟲殺蟲效果更為快速，分析其原因可能是玉米材料不同，殺蟲蛋白活性有差別，同時(shí)與試蟲來源、飼養(yǎng)環(huán)境、飼養(yǎng)方法等有關(guān)。

轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5田間接種3種試蟲后，基本沒有受害癥狀，在心葉期及花絲期對(duì)亞洲玉米螟的抗性、在心葉期對(duì)黏蟲、花絲期對(duì)棉鈴蟲的抗性均達(dá)高抗水平，其平均級(jí)值與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ沼衩?、?dāng)?shù)仄贩N及感蟲品種相比，差異顯著。這與常雪等(2013)對(duì)國產(chǎn)轉(zhuǎn)cry1Ab/cry2Aj基因玉米的研究一致，其抗蟲效果不遜于國外常見轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米(常雪等，2007; 常雪艷等，2006)。目前，國內(nèi)報(bào)道的轉(zhuǎn)基因玉米大多也表現(xiàn)出了對(duì)靶標(biāo)害蟲的良好抗性，如玉米螟對(duì)玉米Bt799的食葉級(jí)別為1級(jí)(武奉慈等，2014)，轉(zhuǎn)cry1Ah基因抗蟲玉米HGK60對(duì)于亞洲玉米螟和棉鈴蟲有很強(qiáng)的殺蟲活性，達(dá)到高抗級(jí)別，但對(duì)于黏蟲為抗性級(jí)別(宋苗等，2016)；BT-X高抗亞洲玉米螟(王培等，2012)，但大部分品種只研究了對(duì)某一種害蟲的抗性或僅研究了田間抗性，需進(jìn)一步研究其綜合抗性。

綜合分析，轉(zhuǎn)基因玉米雙抗505-12-5對(duì)3種重要鱗翅目害蟲在田間及室內(nèi)均表現(xiàn)了顯著的抗蟲性，值得進(jìn)一步研究和推廣應(yīng)用。

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