郭垠利

（貴州師范學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550018）

蛋白質(zhì)（Protein）是人體所需的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是人體中不可或缺的組成成分。蛋白質(zhì)具有多種生理功能，如修復(fù)和構(gòu)成人體組織、參與人體新陳代謝、甚至提供能量等功能。所有的蛋白質(zhì)均含有C、H、O、N四種元素，少部分蛋白質(zhì)還含有S、Fe、Cu、P等元素，其中氮元素在所有蛋白質(zhì)中含量較為穩(wěn)定，約占16%，因此可通過(guò)蛋白質(zhì)中氮元素的含量來(lái)對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定[1]。隨著人們生活水平的提高，人們?cè)絹?lái)越多的通過(guò)攝入蛋白質(zhì)以補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，然后我國(guó)在2008年發(fā)生的三聚氰胺事件，不僅對(duì)我國(guó)奶制品行業(yè)造成極大影響，也反映出我國(guó)對(duì)包括奶粉在內(nèi)的蛋白質(zhì)品含量測(cè)定方法的不足。因此，建立一套科學(xué)、快速、準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，故本文綜述了蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法最新研究進(jìn)展，以期為蛋白質(zhì)含量測(cè)定提供參考。

1 色譜法

色譜法（Chromatography）測(cè)定蛋白質(zhì)含量是利用蛋白質(zhì)在流動(dòng)相與固定相中分配系數(shù)的不同，進(jìn)行相對(duì)運(yùn)動(dòng)時(shí)，蛋白質(zhì)在兩相中多次進(jìn)行分配，從而使蛋白質(zhì)得以分離。色譜法屬于物理分離方法，通常適合用于多組分試驗(yàn)的分離分析。

1.1 高效液相色譜法

高效液相色譜（HPLC）是以液體為流動(dòng)相，利用高壓泵輸送流動(dòng)相進(jìn)入色譜柱，待試樣在色譜柱中分離完畢后，再進(jìn)入檢測(cè)器中，最終實(shí)現(xiàn)待測(cè)試樣的分離分析，該法具有靈敏度高、適用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)[2]。康孟丹等[3]使用HPLC法對(duì)牛初乳中免疫球蛋白的含量進(jìn)行測(cè)定，以甘氨酸鹽和磷酸鹽緩沖溶液作為流動(dòng)相，檢查波長(zhǎng)選為278nm，實(shí)驗(yàn)得出該法測(cè)定牛初乳中免疫球蛋白含量的線性范圍為0.1～1.0mg/L，檢測(cè)限為0.3μg，認(rèn)為該法靈敏度高、簡(jiǎn)單快捷。王浩等[4]利用凝膠過(guò)濾-HPLC法測(cè)定牛奶中α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的含量，實(shí)驗(yàn)測(cè)定兩者的分離度為1.0，同時(shí)回收率可達(dá)到90%以上。

盡管HPLC法具有上述許多優(yōu)點(diǎn)，但由于通常使用的檢測(cè)器為紫外檢測(cè)器，然而蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)通常又較為復(fù)雜且易改變，因此在實(shí)際的分離分析中常出現(xiàn)蛋白質(zhì)死吸附現(xiàn)象，從而使蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果偏低。

1.2 生物質(zhì)譜技術(shù)

當(dāng)前，生物質(zhì)譜技術(shù)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)定性分析與定量測(cè)定等方面。安美忱等[5]通過(guò)探究性試驗(yàn)，對(duì)牛乳鐵蛋白素進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果為18.20 mg /L。Christophc等[6]利用HPLC-MS法測(cè)定牛奶中β-Lg含量時(shí)，通過(guò)使用物理化學(xué)性質(zhì)類(lèi)似的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)物，從而消除提純過(guò)程中β-Lg損失所造成的影響，可準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)對(duì)β-Lg的定量。Felfoul等[7]也利用HPLC-MS法對(duì)牛奶中α-La、β-Lg和Caseins含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度達(dá)到80℃時(shí)，無(wú)法檢測(cè)到前兩者，而后者卻能夠表現(xiàn)較高的活性，并能夠準(zhǔn)確的含量測(cè)定，研究結(jié)果提示對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行含量測(cè)定時(shí)前處理最好避免遭受高溫，從而減少測(cè)量誤差。

1.3 離子交換色譜法

離子交換色譜法不僅能夠應(yīng)用于無(wú)機(jī)離子的含量測(cè)定，也能測(cè)定有機(jī)離子的含量。趙凌國(guó)等[8]利用該法測(cè)定牛奶中乳鐵蛋白的含量，通過(guò)正交試驗(yàn)，確定最佳孵育時(shí)間為2h，洗脫pH為6.0，此條件下可準(zhǔn)確測(cè)定乳鐵蛋白的含量。離子交換色譜法具有損耗率低、交換容量較大等優(yōu)點(diǎn)，不足之處在于對(duì)分子型混合物難以進(jìn)行含量測(cè)定、蛋白質(zhì)峰容易重疊以及分離效果不佳等。

2 分光光度法

分光光度法的基本原理是Lambert-Beer定律，即被測(cè)物含量與吸光強(qiáng)度成正比。因此，可通過(guò)對(duì)待測(cè)物質(zhì)的吸光度從而對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，分光光度法中較為常用的為紫外-可見(jiàn)分光光度法和近紅外分光光度法。

2.1 紫外-可見(jiàn)分光光度法

紫外-可見(jiàn)分光光度法的檢測(cè)波長(zhǎng)為200～800nm，適用于在該范圍內(nèi)能產(chǎn)生吸收的物質(zhì)，不僅可用于含量測(cè)定，也可用于物質(zhì)的鑒別以及雜質(zhì)的檢查。由丹青[9]利用紫外-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定牛奶中蛋白質(zhì)的含量，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該法線性范圍較廣，回收率為93%～101%，RSD為0.5%～0.8%，含量測(cè)定結(jié)果較為準(zhǔn)確。李良等[10]通過(guò)比較紫外-分光光度法和凱氏定氮法在蛋白質(zhì)含量測(cè)定方面的異同，發(fā)現(xiàn)兩種方法測(cè)定結(jié)果并無(wú)明顯差異，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)紫外-分光光度法測(cè)定大批量樣品蛋白質(zhì)的具有明顯的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，其他研究人員也利用紫外-分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)含量[11-13]。

2.2 近紅外分光光度法

近紅外分光光度法檢測(cè)波長(zhǎng)為780～2526nm，適用于在該范圍內(nèi)能產(chǎn)生吸收的物質(zhì)。李雙紅等[14]通過(guò)正交試驗(yàn)，對(duì)牛奶中蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定，利用多種方法建模，并對(duì)其進(jìn)行評(píng)定，結(jié)果顯示一胎和二胎奶牛中乳蛋白具有相同的最優(yōu)模型，這為測(cè)定原料牛奶中含量提供了理論上的依據(jù)。單楊等[15]建立了蛋白質(zhì)預(yù)測(cè)模型，蛋白質(zhì)含量利用凱氏定氮法求出，該模型的優(yōu)點(diǎn)為檢測(cè)成本低、應(yīng)用范圍較廣等，但其準(zhǔn)確度與精確度等需要提高。

3 滴定法

滴定法的原理是當(dāng)?shù)竭_(dá)滴定終點(diǎn)時(shí)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)溶液的消耗量求出待測(cè)溶液的濃度，主要分為人工滴定法與自動(dòng)電位滴定法兩類(lèi)。高美玲等[16]認(rèn)為，凱氏定氮法誤差較大，因此對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)加入乙醇沉淀蛋白質(zhì)，并通過(guò)濃硫酸消耗該沉淀，最終實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)含量的目的。周曉琳等[17]對(duì)凱氏定氮法進(jìn)行優(yōu)化后，確保了凱氏定氮法能夠準(zhǔn)確測(cè)定高蛋白的含量。王靜等[18]認(rèn)為人工滴定誤差較大，從而研制出自動(dòng)凱氏定氮儀，不僅減少了試驗(yàn)誤差，還具有檢測(cè)速度快、分辨率高等優(yōu)點(diǎn)。何莉萍[19]探究了影響蛋白質(zhì)含量測(cè)定的因素，發(fā)現(xiàn)測(cè)定條件在pH＜3、測(cè)定溫度25℃時(shí)，線性范圍廣，同時(shí)線性關(guān)系也較好。

4 酶聯(lián)免疫吸附法

該法是由荷蘭兩學(xué)者于1971年提出，其基本原理是通過(guò)酶與復(fù)合物的結(jié)合產(chǎn)生顏色反應(yīng)，通過(guò)顏色的深淺對(duì)待測(cè)物進(jìn)行定量測(cè)定。酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）經(jīng)文獻(xiàn)報(bào)道也能應(yīng)用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定中。馬智偉等[20]通過(guò)應(yīng)用優(yōu)化后的前處理方法獲得到了高純度的IgG，利用HRP-兔抗牛IgG作為二抗，使用ELISA法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定。也可利用ELISA法對(duì)初乳、過(guò)渡乳和成熟乳中蛋白質(zhì)的含量進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)LF的含量依次降低，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，LF的含量與孕婦所攝取的營(yíng)養(yǎng)有關(guān)，與體重、年齡等無(wú)明顯關(guān)系。ELISA法具有操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠放大反應(yīng)的效果，可進(jìn)一步提高ELISA法測(cè)定蛋白質(zhì)的靈敏度。但該方法有時(shí)會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性與假陰性結(jié)果，易受到交叉免疫性的影響[21]。

5 聯(lián)合測(cè)定法

在實(shí)際的測(cè)定過(guò)程中，有時(shí)一種方法不能夠準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，此時(shí)就需同時(shí)應(yīng)用兩種或兩種以上的方法才能實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)含量準(zhǔn)確測(cè)定的目的。孫雯[22]將凱氏定氮法與等電點(diǎn)法聯(lián)用，沉淀的條件為酸性，而復(fù)溶的條件為堿性，從而利用凱氏定氮法測(cè)定乳蛋白含量。樂(lè)薇等[23]通過(guò)數(shù)碼比色法測(cè)定牛乳中蛋白質(zhì)的含量，采用考馬斯亮藍(lán)染色，從而計(jì)算蛋白質(zhì)含量，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該法RSD＜2%，同時(shí)加樣回收率在98%～103%范圍內(nèi)，上述兩種方法聯(lián)用具有測(cè)定時(shí)間短、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。

6 氨基酸折算法

除上述蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法外，氨基酸折算法也可用于蛋白質(zhì)含量的測(cè)定。國(guó)外研究機(jī)構(gòu)使用氨基酸折算法測(cè)定奶粉中乳清蛋白和酪蛋白的含量，檢測(cè)的理論基礎(chǔ)為Asx、Ala、Phe和Pro四種氨基酸的含量，通過(guò)這四種氨基酸的含量從而可折算出奶粉中乳清蛋白和酪蛋白的含量。李爽等[24]通過(guò)對(duì)上述蛋白質(zhì)測(cè)定方法進(jìn)行評(píng)估后發(fā)現(xiàn)，并不是所有奶粉都能夠應(yīng)用氨基酸折算法測(cè)定蛋白質(zhì)的含量，例如含豆配方奶粉中含有的大豆分離蛋白在測(cè)定過(guò)程中能夠改變氨基酸的組成，因此該法不適用于含豆配方奶粉蛋白質(zhì)含量測(cè)定。

7 結(jié)語(yǔ)

我國(guó)是一個(gè)人口大國(guó)，食品安全問(wèn)題較為突出，本文綜述了蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法最新研究進(jìn)展，總結(jié)歸納了色譜法、分光光度法、滴定法、酶聯(lián)免疫吸附法、聯(lián)合測(cè)定法以及氨基酸折算法六種蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法，同時(shí)比較了上述測(cè)定方法的優(yōu)缺點(diǎn)。由于部分蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法存在檢測(cè)費(fèi)用高、檢測(cè)過(guò)程復(fù)雜等缺點(diǎn)，因此，建立檢測(cè)成本低、操作簡(jiǎn)便的蛋白質(zhì)含量測(cè)定方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。