李開心　劉彥妮　于寶佳　岳潔瑜　王華忠

摘 要：細胞內(nèi)自噬水平監(jiān)測方法的建立是深入揭示自噬調(diào)控機制和生理功能的重要基礎(chǔ)。ATG8蛋白定位于自噬小體膜上，對其熒光蛋白標記分子的熒光觀察是監(jiān)測細胞內(nèi)自噬發(fā)生水平的重要方法。本研究選擇小麥ATG8家族的TaATG8h基因，構(gòu)建了GFP-TaATG8h和DsRED-TaATG8h融合基因表達載體，載體構(gòu)建的正確性得到酶切和測序結(jié)果的確認；以易于轉(zhuǎn)化的小麥原生質(zhì)體為受體，實現(xiàn)了兩個融合基因在原生質(zhì)體細胞中的高效表達，在表達融合蛋白的細胞中觀察到了清晰的熒光。本研究結(jié)果為在重要農(nóng)作物小麥上建立以ATG8為靶標的自噬水平監(jiān)測技術(shù)和深入探索自噬在小麥生長發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥；細胞自噬；ATG8；原生質(zhì)體

中圖分類號：S512.1 文獻標識碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.03.004

Abstract： The establishment of autophagy monitoring method was important for revealing the regulation mechanisms and physiological functions of autophagy. ATG8 locates on autophagosome membranes and its fluorescent protein-tagged forms have been successfully used to monitor autophagy level in cells. In this study， TaATG8h， one member of the wheat ATG8 family， was selected and GFP-TaATG8h and DsRED-TaATG8h fusion gene expression vectors were constructed. The correctness of constructed vectors was confirmed by results of restriction enzyme digestion and DNA sequencing. Wheat protoplasts， which were easily transformed with genes， were used to express the two fusion genes， and clear fluorescence was observed in the cells expressing fusion proteins. The results of this study laid a foundation for establishing ATG8-based autophagy monitoring technology and for exploring the role of autophagy in the important crop species of wheat.

Key words：wheat； autophagy； ATG8； protoplast

細胞自噬（autophagy）是真核生物細胞內(nèi)一種保守的物質(zhì)分解和循環(huán)利用機制。在自噬過程中，細胞質(zhì)內(nèi)待降解底物被包裹進雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬小體，隨著自噬小體外膜與液泡（動物是溶酶體）膜的融合，內(nèi)膜及包裹的底物（此時稱為自噬小泡）進入液泡腔被分解[1-3]。多種自噬相關(guān)因子（autophagy-related factor，ATG）參與到自噬小體組裝、底物選擇、自噬小體與液泡的融合及這其中的信號調(diào)控等過程。ATG8是自噬核心機制中研究得最清楚的ATG因子，其通過一個類泛素化過程與脂類分子磷脂酰乙醇胺（PE）連接形成ATG8-PE定位于自噬小體內(nèi)、外膜表面，藉此征集其他ATG因子推動自噬小體膜的起始、延伸、合攏及與液泡的融合等過程[4-6]。細胞內(nèi)自噬水平的監(jiān)測是開展自噬分子機制和生理功能研究的必要手段。鑒于ATG8對自噬小體膜的標志性裝飾，其被熒光蛋白標記后在細胞內(nèi)的點狀熒光可作為觀察指標來表征細胞內(nèi)的自噬小體積累情況，從而反應(yīng)細胞內(nèi)自噬的發(fā)生水平[7]。目前此類方法已經(jīng)在酵母、動物和模式植物擬南芥、水稻上得到應(yīng)用[8-9]，但在重要農(nóng)作物小麥上還未見報道。

酵母只有一個ATG8，而高等生物ATG8則是由多個成員構(gòu)成的基因家族。此前，我們在小麥上鑒定了9個ATG8（TaATG8a-8h）基因，證實他們參與了小麥的細胞自噬過程[10]。在此基礎(chǔ)上，本研究構(gòu)建了小麥TaATG8h的GFP和DsRED融合基因表達載體，并實現(xiàn)了融合基因在小麥葉肉細胞原生質(zhì)體中的高效表達，旨在為在小麥上建立以ATG8為靶標的自噬水平監(jiān)測技術(shù)和深入探索自噬在小麥生長發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 表達載體的構(gòu)建

小麥TaATG8h由本實驗室克隆，其全長 cDNA保存于 pLB-ATG8h載體上。以載體pA7-GFP為基礎(chǔ)構(gòu)建融合基因表達載體，該載體上含有XbaⅠ和SacⅠ位點用于插入目標基因并與GFP融合。設(shè)計合成用于擴增TaATG8h完整ORF的引物對8h-F（GCTCTAGAAATGA AGTCCTTCAAGAAGGA）/8h-R（CGAGCTCTCACCCAAATGTCTTCTCGC）。使用該引物對和pfu DNA聚合酶，以pLB-ATG8h質(zhì)粒為模板進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物和pA7-GFP質(zhì)粒經(jīng)XbaⅠ/SacⅠ雙酶切后進行連接。使用酶切和測序方法鑒定重組克隆，隨后將構(gòu)建的GFP-TaATG8h融合基因表達載體命名為pGFP-A8h。DsRED-TaATG8h融合基因表達載體pRED-A8h的構(gòu)建是以pGFP-A8h為基礎(chǔ)，將該載體上的GFP基因替換為DsRED基因。其過程為：使用引物對DsRed-F（CCGCTCGAGATGGCCTCCTCCGAGAACGTCATCA） /DsRed-R（GCTCTAGAGCCAGGAACAGGTGGTGGCGGC）從pHBT-DsRed-NOS載體上擴增不含終止密碼子的DsRED基因ORF序列，擴增產(chǎn)物經(jīng)XhoⅠ/XbaⅠ雙酶切后替換pGFP-A8h載體上的GFP基因ORF。構(gòu)建的pRED-A8h載體經(jīng)酶切和測序進行確認。使用去內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒EndoFree Plasmid Maxi Kit （Qiagen）提取pGFP-A8h和pRed-A8h載體質(zhì)粒，濃度調(diào)至1 μg·μL-1，用于后續(xù)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。

1.2 小麥葉肉細胞原生質(zhì)體的制備和基因轉(zhuǎn)化

選取健康飽滿的蘇麥3號種子置于培養(yǎng)皿中萌發(fā)。將出芽后的種子移至營養(yǎng)土，并置于人工氣候箱中，于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗條件下生長，待幼苗長至5 cm左右時改為24 h黑暗條件誘導黃化苗。當黃化苗第二片真葉長至10 cm左右時，取第二片真葉參照杜曉敏等[11]方法進行葉肉細胞原生質(zhì)體的制備和PEG-Ca2+介導的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。將轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)懸浮至1 mL的WI溶液（0.7 mol·L-1甘露醇，4 mmol·L-1 MES，20 mmol·L-1 KCl）中，于室溫、黑暗條件下靜置保存。

1.3 熒光觀察

轉(zhuǎn)化后24 h，吸取原生質(zhì)細胞置于血球計數(shù)板上，在正置熒光顯微鏡（DM5000，Leica）下觀察細胞內(nèi)GFP或DsRED熒光。

2 結(jié)果與分析

2.1 GFP/DsRED-TaATG8h融合基因表達載體的構(gòu)建

成熟ATG8的C末端必須是甘氨酸殘基，并通過該殘基與PE連接后定位至自噬膜上。對于剛翻譯完成的ATG8，其C端甘氨酸外側(cè)的多余殘基會由ATG4加工切除。因此，構(gòu)建ATG8的融合基因表達載體時，一般將ATG8序列融合于熒光蛋白基因的下游。使用常規(guī)的酶切、連接和大腸桿菌轉(zhuǎn)化方法構(gòu)建GFP-TaATG8h融合基因的表達載體pGFP-A8h。

候選重組質(zhì)粒經(jīng)插入位點兩側(cè)的XbaⅠ/SacⅠ雙酶切能夠正確切出368 bp 的TaATG8h基因片段（圖1A），結(jié)合DNA測序結(jié)果，表明GFP-TaATG8h融合基因表達載體（pGFP-A8h）構(gòu)建正確；圖1A上方顯示了該載體上GFP-TaATG8h融合基因表達盒的結(jié)構(gòu)，融合基因的表達由兩個串聯(lián)的35S啟動子驅(qū)動。

DsRED-TaATG8h融合基因表達載體pRED-A8h的構(gòu)建是以構(gòu)建好的pGFP-A8h為基礎(chǔ)，使用XhoⅠ/XbaⅠ切點將載體上的GFP基因替換為DsRED基因。候選重組質(zhì)粒經(jīng)XhoⅠ/XbaⅠ雙酶切能夠正確切出694 bp的DsRED基因片段（圖1B），結(jié)合DNA測序結(jié)果，表明pRED-A8h載體的構(gòu)建正確；圖1B上方顯示了該載體上DsRED-TaATG8h融合基因表達盒的結(jié)構(gòu)，融合基因的表達同樣由兩個串聯(lián)的35S啟動子驅(qū)動。

2.2 GFP/DsRED-TaATG8h融合基因的小麥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和表達

使用PEG-Ca2+介導的轉(zhuǎn)化方法將構(gòu)建的兩個融合基因表達載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到小麥葉肉細胞原生質(zhì)體中。轉(zhuǎn)化后24 h的熒光觀察結(jié)果顯示，兩個融合基因GFP-TaATG8h和DsRed-TaATG8h均能夠在原生質(zhì)體中正確表達，GFP-TaATG8h融合蛋白在細胞中發(fā)出綠色的熒光（圖2A），DsRed-TaATG8h融合蛋白在細胞中發(fā)出紅色的熒光（圖2B）；兩個融合基因的轉(zhuǎn)化效率均超過50%。

3 結(jié)論與討論

自噬與植物的生長、發(fā)育、衰老和逆境響應(yīng)等過程密切相關(guān)[12-14]。細胞內(nèi)自噬水平監(jiān)測方法的建立是深入揭示自噬調(diào)控機制和生理功能的重要基礎(chǔ)。ATG8蛋白定位于自噬小體膜上，因而是自噬小體的重要標志分子。應(yīng)用上通常使用轉(zhuǎn)化方法在細胞內(nèi)表達熒光蛋白標記的ATG8，進而通過對細胞內(nèi)點狀熒光的觀察和統(tǒng)計來反映自噬小體的積累和自噬發(fā)生的程度[7]。植物上，此類自噬監(jiān)測方法已經(jīng)在擬南芥和水稻等模式物種上得到應(yīng)用[8-9]，但在重要農(nóng)作物小麥上還未見報道，限制了對小麥自噬功能的深入研究。建立靶向ATG8的自噬監(jiān)測方法的前提是構(gòu)建熒光蛋白基因-ATG8融合基因表達載體，并通過轉(zhuǎn)化實現(xiàn)融合蛋白在細胞內(nèi)的高效表達和熒光激發(fā)。本研究選擇小麥ATG8家族的TaATG8h基因，構(gòu)建了該基因融合于GFP/DsRED下游的融合基因表達載體，載體構(gòu)建的正確性得到酶切和測序結(jié)果的確認；以易于進行基因轉(zhuǎn)化的小麥葉肉細胞原生質(zhì)體為受體，通過轉(zhuǎn)化實現(xiàn)了兩個融合基因在原生質(zhì)體細胞中的高效表達，在表達融合蛋白的細胞中觀察到了清晰的熒光。本研究結(jié)果為在小麥上建立以ATG8為靶標的自噬水平監(jiān)測技術(shù)和深入探索自噬在小麥生長發(fā)育中的作用奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]LIU Y， BASSHAM D C. Autophagy： pathways for self-eating in plant cells [J]. Annu rev plant biol， 2012， 63： 215-237.

[2]LI F， VIERSTRA R D. Autophagy： a multifaceted intracellular system for bulk and selective recycling[J]. Trends plant sci， 2012， 17： 526-537.

[3]YOSHIMOTO K. Beginning to understand autophagy， an intracellular self-degradation system in plants[J]. Plant cell physiol， 2012， 53： 1355-1365.

[4]NAKATOGAWA H， ICHIMURA Y， OHSUMI Y. Atg8， a ubiquitin-like protein required for autophago- some formation， mediates membrane tethering and hemifusion[J]. Cell， 2007， 130： 165-178.

[5]XiE Z， NAIR U， KLIONSKY D J. Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation[J]. Mol biol cell， 2008， 19： 3290-3298.

[6]NAIR U， YEN W L， MARI M， et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis[J]. Autophagy， 2012， 8： 780-793.

[7]KLIONSKY D J， ABDELMOHSEN K， ABE A， et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy （3rd edition） [J]. Autophagy， 2016， 12： 1-222.

[8]CONTENTO A L， XIONG Y， BASSHAM D C. Visualization of autophagy in Arabidopsis using the fluorescent dye monodansylcadaverine and a GFP-AtATG8e fusion protein[J]. Plant J， 2005， 42： 598-608.

[9]IZUMI M， HIDEMA J， WADA S， et al. Establishment of monitoring methods for autophagy in rice reveals autophagic recycling of chloroplasts and root plastids during energy limitation[J]. Plant physiol， 2015， 167： 1307-1320.

[10]PEI D， ZHANG W， SUN H， et al. Identification of autophagy-related genes ATG4 and ATG8 from wheat （Triticum aestivum L.） and profiling of their expression patterns responding to biotic and abiotic stresses[J]. Plant cell rep， 2014， 33： 1697-1710.

[11]杜曉敏， 王均， 安子玄， 等. 小麥葉肉細胞原生質(zhì)體制備參數(shù)解析及在基因瞬時表達上的應(yīng)用[J]. 華北農(nóng)學報， 2015， 30（6）： 52-60.

[12]BASSHAM D C， LAPORTE M， MARTY F， et al. Autophagy in development and stress responses of plants[J]. Autophagy， 2006， 2： 2-11.

[13]HAYWARD A P， DINESH-KUMAR S P. What can plant autophagy do for an innate immune response[J]. Annu rev phytopathol， 2011， 49： 557-576.