陳 鵬 王清良 胡鄂明 李 乾 劉天印 陳 寬

(1.南華大學(xué)核資源工程學(xué)院，湖南 衡陽 421001；2.核燃料循環(huán)技術(shù)與裝備協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南 衡陽 421001)

浸鈾菌種多為中溫菌，最適宜的生長溫度為25～40 ℃[1-3]。因而，在新疆地區(qū)進(jìn)行細(xì)菌浸鈾就面臨著巨大的挑戰(zhàn)。李聰?shù)萚4]對新疆伊犁河谷地區(qū)近50 a來的氣候研究表明：該地區(qū)春季平均氣溫為9.9 ℃，夏季平均氣溫為20.5 ℃，秋季平均氣溫為8.6 ℃，冬季平均氣溫為-7 ℃。另據(jù)現(xiàn)場觀測，伊犁河谷地區(qū)某鈾水冶車間吸附尾液溫度在10～17 ℃，中溫菌在此類尾液中會出現(xiàn)生長活性不高，氧化Fe2+速率慢等情況，嚴(yán)重時甚至出現(xiàn)細(xì)菌生長和繁殖停止等問題，以至于細(xì)菌浸鈾技術(shù)未能在新疆酸法地浸采鈾礦山推廣應(yīng)用。

針對上述問題，本試驗采用耐冷嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillusferrivorans簡稱A.ferrivorans)作氧化劑，該菌具有好氧嗜酸特性，可在5～30 ℃生長繁殖[5-6]。M.Liljeqvist等[7]指出，A.ferrivorans是一種嗜酸菌，通過氧化Fe2+和硫化物獲取能量，并從二氧化碳獲得有機(jī)碳。A.Amouric等[8]對A.ferrivorans的運(yùn)動性、鞭毛的有無、基因差異性等特征進(jìn)行了詳細(xì)研究。S.Christel等[9]利用RNA轉(zhuǎn)錄測序揭示了A.ferrivorans對無機(jī)硫化合物的氧化途徑。C.González等[10]通過基因組分析了A.ferrivorans的遺傳變異性，為細(xì)菌應(yīng)用于生物冶金以及含硫廢水的處理提供理論依據(jù)。Pinar Aytar等[11]從某礦山酸性廢水中分離純化了一株嗜酸硫桿菌，經(jīng)16S rRNA基因測序和做系統(tǒng)發(fā)育樹，得出該菌是一株A.ferrivorans，并且具有較強(qiáng)的脫硫效果以及氧化Fe2+能力。R.Ccorahua 等[12]從秘魯某銅礦山酸性礦坑中分離純化出一株A.ferrivorans，并研究了該菌浸礦的最適宜溫度、pH以及生長動力學(xué)，表明該菌具有較好的應(yīng)用前景。劉敏瑞等[13]采用16S rRNA 基因、RubisCO功能基因序列分析篩選來自新疆富蘊(yùn)縣的A.ferrivorans，表明A.ferrivorans與其棲息環(huán)境有一定的聯(lián)系。余水靜等[14]利用生物信息學(xué)方法鑒定和分析了一株A.ferrivorans的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)(TCS)結(jié)構(gòu)特征，表明A.ferrivorans具有嗜酸硫桿菌共有的TCS功能，如氮素固定及代謝調(diào)節(jié)、檸檬酸蘋果酸代謝調(diào)節(jié)等，而特有的TCS功能涉及趨化性調(diào)控、重金屬響應(yīng)等。趙永紅等[15]利用生物信息學(xué)方法挖掘出A.ferrivorans與其他嗜酸硫桿菌共49個抗砷基因，發(fā)現(xiàn)一些抗砷基因為嗜酸硫桿菌所共有，說明這類基因是嗜酸硫桿菌抗砷所必需的基因，有助于A.ferrivorans適應(yīng)極端環(huán)境。莫曉蘭等[16]通過對4株菌種在高氟環(huán)境下進(jìn)行馴化，選育出了一株具有較高耐氟能力的菌種，運(yùn)用16S rRNA基因克隆文庫技術(shù)分析表明：該菌與A.ferrivorans菌相似度達(dá)到99%，并且具有較強(qiáng)的抗氟性和嗜鐵性，A.ferrivorans菌將在含氟鈾礦石的生物浸出中發(fā)揮重要作用。

目前，國內(nèi)外雖有對A.ferrivorans性能研究的相關(guān)報道，但多集中于該菌耐受機(jī)理的理論研究，而A.ferrivorans菌作為酸法地浸鈾礦山氧化劑的研究卻鮮有報道。試驗參照新疆某酸法地浸采鈾礦山吸附尾液溫度、pH以及生產(chǎn)工藝條件，初步研究了A.ferrivorans菌氧化Fe2+的特性，并在現(xiàn)場進(jìn)行細(xì)菌的耐酸馴化，首次采用耐酸性強(qiáng)、比表面積大、直徑為3～5 mm的生物陶粒作為浸鈾細(xì)菌掛膜載體，對細(xì)菌進(jìn)行固定化培養(yǎng)，提高單位體積的細(xì)菌數(shù)量，從而加快細(xì)菌連續(xù)氧化Fe2+速率，為A.ferrivorans菌代替中溫菌在低溫和高酸環(huán)境下作氧化劑提供依據(jù)。

1 試驗材料及儀器

A.ferrivorans和A.ferrooxidans均來自于南華大學(xué)鈾礦冶生物技術(shù)實驗室，9K培養(yǎng)基試劑和FeSO4·7H2O購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，吸附尾液取自新疆中核天山鈾業(yè)有限公司某廠水冶車間，耐酸生物陶粒購自滎陽綠錦活性炭有限公司，IS-RDD3臺式恒溫振蕩器購自美國精騏有限公司，有機(jī)玻璃生物反應(yīng)器(圖1)為自制。

圖1 生物反應(yīng)器

2 試驗方法

2.1 細(xì)菌氧化Fe2+的活性表征

A.ferrivorans和A.ferrooxidans在生長和繁殖過程中，作為電子傳遞鏈上的各種細(xì)胞色素都具有特定的氧化還原電位，隨著Fe3+濃度的升高，培養(yǎng)液的氧化性隨之增強(qiáng)，并且細(xì)菌以氧化Fe2+成Fe3+作為主要代謝途徑，即細(xì)菌氧化Fe2+的速率與細(xì)菌的生長速率存在正相關(guān)關(guān)系[17]。所以細(xì)菌的活性通過測定培養(yǎng)液的氧化還原電位以及Fe2+的氧化速率來表征。

2.2 分析方法

試驗用重鉻酸鉀滴定法測定培養(yǎng)液的Fe2+濃度，分析步驟及方法參見文獻(xiàn)[16]；用pH計(pHS-3C)測定培養(yǎng)液的pH、氧化還原電位(簡稱Eh)。

2.3 培養(yǎng)基成分與菌種活化

試驗所用9K培養(yǎng)基成分見表1，用2 mol/L硫酸溶液調(diào)節(jié)pH,另據(jù)條件試驗Fe2+濃度要求添加 FeSO4·7H2O。為保證菌種活性，每次條件試驗前，需對菌種進(jìn)行活化培養(yǎng)。取2個250 mL錐形瓶，分別加入90 mL Fe2+濃度為1 g/L的9K培養(yǎng)基(pH=2.0)以及10 mL的A.ferrivorans或A.ferrooxidans(即按10%的體積分?jǐn)?shù)接種)，測定初始Eh，置于恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min，培養(yǎng)至Eh為500 mV左右即可作為接種菌種用于條件試驗。

表1 9K培養(yǎng)基成分

2.4 接種量對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

取6個250 mL錐形瓶，按5%、10%、20%、30%、40%、50%接種比例分別加入A.ferrivorans菌液7.5 mL、15 mL、30 mL、45 mL、60 mL、75 mL，再依次加入Fe2+濃度為1 g/L的9K培養(yǎng)基(pH=2.0)142.5 mL、135 mL、120 mL、105 mL、90 mL、75 mL。測定初始Eh及Fe2+濃度，置于恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min，開始培養(yǎng)，每隔6 h測定Eh及Fe2+濃度，直至Fe2+氧化完全。

2.5 初始Fe2+濃度對A.ferrivorans生長活性的影響

取3個250 mL錐形瓶，分別加入初始Fe2+濃度為0.3 g/L、0.4 g/L、0.5 g/L的9K培養(yǎng)基(pH=2.0)135 mL以及15 mL的A.ferrivorans菌液，測定初始Eh及Fe2+濃度，置于恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min，開始培養(yǎng)，每隔6 h測定Eh及Fe2+濃度，直至Fe2+被全部氧化。

2.6 溫度對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

取2個250 mL錐形瓶，分別加入135 mL Fe2+濃度為1 g/L的培養(yǎng)基(pH=2.0)以及15 mLA.ferrivorans或A.ferrooxidans菌液。測定初始Eh及Fe2+濃度，置于恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)溫度為5 ℃、轉(zhuǎn)速為170 r/min，開始培養(yǎng)，每隔24 h測定Eh及Fe2+濃度，其他溫度條件(15、25 ℃)按相同方法依次進(jìn)行。

2.7 A.ferrivorans的耐酸馴化

量取300 mL吸附尾液(成分見表2)至錐形瓶中，加入4.5 g濃硫酸和1.5 g FeSO4·7H2O，攪拌至溶解,再加入300 mL的A.ferrivorans菌液。測定初始Eh、pH，置于水浴恒溫振蕩器中，調(diào)節(jié)溫度為25 ℃、轉(zhuǎn)速為160 r/min，開始培養(yǎng)，每隔12 h測定Eh、pH。當(dāng)培養(yǎng)液Eh達(dá)到550 mV左右時，量取此培養(yǎng)液300 mL作為接種菌液，按上述方法進(jìn)行第二、三、四、五次耐酸馴化。

表2 吸附尾液成分

2.8 A.ferrivorans固定化培養(yǎng)

向裝有5 L生物陶粒的反應(yīng)器中加入2 L Fe2+濃度為1 g/L、pH=2.0的9K培養(yǎng)基，再加入0.4 L的A.ferrivorans菌液，測定初始Eh，調(diào)節(jié)通氣量為 5 L/min，開始培養(yǎng)，每隔1 h測定培養(yǎng)液Eh和Fe2+濃度；待Fe2+氧化完成時，向反應(yīng)器中加10 g FeSO4·7H2O，當(dāng)Fe2+被完全氧化后，再補(bǔ)加1次 10 g FeSO4·7H2O；為驗證細(xì)菌固定化效果，在保證反應(yīng)器中生物陶粒不發(fā)生位置移動的前提下，排盡反應(yīng)器中培養(yǎng)液后，不添加菌液，只加2 L Fe2+濃度為1 g/L、 pH=2.0的9K培養(yǎng)基，測定初始Eh，再調(diào)節(jié)通氣量為5 L/min，培養(yǎng)至Fe2+全部氧化完成，按此方法重復(fù)8次。

細(xì)菌固定化完成后，取少量生物陶粒，加入濃度為4%的戊二醛固定處理，放入溫度為4 ℃的冰箱內(nèi)保存，用于掃描電鏡分析。

2.9 固定化細(xì)菌與游離細(xì)菌氧化Fe2+速率的對比

細(xì)菌固定化培養(yǎng)結(jié)束后，放出反應(yīng)器中的培養(yǎng)液，將此培養(yǎng)液均分成2份備用。放出反應(yīng)器中的一半陶粒，再加入1份備用培養(yǎng)液，記為A培養(yǎng)液；另1份培養(yǎng)液加入未裝填生物陶粒的反應(yīng)器中，記為B培養(yǎng)液，再向A、B培養(yǎng)液中分別加5 g FeSO4·7H2O，測定初始培養(yǎng)液的Eh，均在通氣量為5 L/min下培養(yǎng)，每隔1 h測定Eh和Fe2+濃度，進(jìn)一步驗證細(xì)菌在生物陶粒上的固定化效果。

3 試驗結(jié)果與討論

3.1 接種量對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

細(xì)菌接種量直接影響培養(yǎng)液中的細(xì)菌基數(shù)，從而影響細(xì)菌的整體增殖速度和氧化Fe2+的速率。接種量對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響見圖2。

從圖2(a)可知，培養(yǎng)液初始電位隨著細(xì)菌接種量的增加而增大，不同培養(yǎng)液中的細(xì)菌都在30 h左右開始進(jìn)入對數(shù)生長期，表明接種量對細(xì)菌遲緩期的影響較小。從圖2(b)可知，接種量從5%提高至50%，F(xiàn)e2+濃度下降的速率越來越快，表明培養(yǎng)液氧化Fe2+的速率加快，F(xiàn)e2+的氧化時間縮短。從代謝產(chǎn)物對細(xì)菌活性的影響[18]以及生產(chǎn)成本考慮，A.ferrivorans的接種量以10%為宜。

3.2 Fe2+初始濃度對A.ferrivorans生長活性的影響

對于A.ferrivorans來說，可利用Fe2+氧化成Fe3+過程中產(chǎn)生的能量來維持自身的生長繁殖。Kevin等[6]的研究表明，A.ferrivorans與A.ferrooxidans的DNA染色體的G+C只有4%不同，因此，A.ferrivorans可能類似于A.ferrooxidans，在產(chǎn)能過程中也需要Fe2+將電子傳遞給分子氧，傳遞過程中細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有質(zhì)子消耗，從而驅(qū)動ATP的合成來維持細(xì)菌的活性[19-20]。圖3為Fe2+初始濃度對A.ferrivorans生長活性的影響結(jié)果。

圖2 接種量對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

從圖3可知，氧化還原電位上升的幅度大致相當(dāng)，且Fe2+的氧化速率也大致相當(dāng)，這表明Fe2+的初始濃度對A.ferrivorans生長活性的影響較小，細(xì)菌完全可以在Fe2+含量為0.3～0.5 g/L的吸附尾液中較好地生長和繁殖。

圖3 不同初始Fe2+濃度對A.ferrivorans生長活性的影響

3.3 溫度對A.ferrivorans氧化Fe2+速率的影響

溫度對A.ferrivorans與A.ferrooxidans氧化Fe2+速率的影響見圖4。

圖4 溫度對A.ferrivorans與A.ferrooxidans氧化Fe2+速率的影響

從圖4可知，溫度在5～25 ℃時，2種細(xì)菌氧化Fe2+速率都隨著溫度的升高而加快，A.ferrivorans尤為明顯，說明隨著溫度的升高，細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜流動性隨之變大，這有利于營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)和代謝產(chǎn)物排出胞外，使細(xì)菌的生長繁殖加快，促使細(xì)菌氧化速率增加。在試驗溫度條件下，A.ferrivorans培養(yǎng)液中Eh上升的速度和Fe2+的氧化速率均高于A.ferrooxidans培養(yǎng)液。當(dāng)溫度為5 ℃，可能是由于A.ferrooxidans的細(xì)胞膜呈晶格排列，營養(yǎng)物質(zhì)的運(yùn)輸受阻，酶促反應(yīng)停止，導(dǎo)致細(xì)菌幾乎處于停止生長狀態(tài)，而A.ferrivorans能繼續(xù)生長并保持較好的氧化性，主要是因為該菌自身具有耐冷基因以及脂肪酸合成中的特有基因族利于在低溫環(huán)境中生長[21-22]，從文獻(xiàn)[14]也可以推測，A.ferrivorans特有的TCS功能涉及耐冷調(diào)控。A.ferrivorans與A.ferrooxidans在生長繁殖過程中所發(fā)生的一系列化學(xué)反應(yīng)絕大多數(shù)都是在特定酶催化作用下完成的，每一種酶都有合適的酶促反應(yīng)溫度，溫度的變化影響酶促反應(yīng)率，進(jìn)而影響菌體的活性，結(jié)合新疆酸法地浸鈾礦山所處的氣候條件，A.ferrivorans更適于用作浸鈾的目標(biāo)菌種。

3.4 A.ferrivorans的耐酸馴化

在細(xì)菌生長和繁殖過程中，機(jī)體內(nèi)發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)大多是酶促反應(yīng)，而酶促反應(yīng)必須在一定的pH范圍內(nèi)進(jìn)行，在此范圍內(nèi)只要條件適合，酶促反應(yīng)率達(dá)到最高，細(xì)菌生長活性最好，所以培養(yǎng)液的酸堿度是影響細(xì)菌生長活性的重要因素之一。細(xì)菌耐酸馴化試驗結(jié)果見圖5，圖中1～5代表馴化次數(shù)。

圖5 A.ferrivorans耐酸馴化試驗

從圖5(a)可知，A.ferrivorans第1次耐酸馴化時，細(xì)菌緩慢生長期較長，約為96 h；隨著馴化次數(shù)增加，緩慢生長期縮短，對數(shù)生長期提前，細(xì)菌耐受酸的能力明顯增強(qiáng)。表明A.ferrivorans在酸度較高的培養(yǎng)液中形成越來越完善的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制，使細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的生物化學(xué)反應(yīng)能高度有序進(jìn)行。從圖5(b)可知，當(dāng)培養(yǎng)液pH=0.31時，A.ferrivorans仍能保持較好的生長活性和氧化性，這也表明，A.ferrivorans經(jīng)耐酸馴化后，完全適應(yīng)酸法地浸采鈾礦山吸附尾液環(huán)境。

3.5 A.ferrivorans固定化培養(yǎng)

在自然界中，細(xì)菌往往并不是以游離態(tài)存在和生長繁殖，而是會成群吸附到固體表面，共同分泌以多糖、蛋白質(zhì)和DNA為主要成分的黏液到細(xì)胞外，形成多層有序的群體結(jié)構(gòu)——能把自己包裹起來的生物膜。生物膜上分布有許多微小孔道，有利于營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入膜內(nèi)、代謝產(chǎn)物排出膜外，維持整個生物膜內(nèi)細(xì)菌群體的生長和繁殖[23]。在適宜的生長環(huán)境下，A.ferrivorans菌也有形成生物膜的特點。

A.ferrivorans固定化培養(yǎng)試驗在室內(nèi)進(jìn)行，反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)液溫度為19～20 ℃，試驗結(jié)果見圖6、圖7，圖6中的1～10代表固定化培養(yǎng)次數(shù)。

圖6 A.ferrivorans在生物陶粒上的固定化培養(yǎng)

從圖6可知，對細(xì)菌進(jìn)行第2次固定化培養(yǎng)時，F(xiàn)e2+的氧化速率約為第1次的2倍，這是由于在第1次固定化培養(yǎng)后，在不更換培養(yǎng)基的情況下，直接補(bǔ)加2次FeSO4·7H2O進(jìn)行靜態(tài)培養(yǎng)，在此期間，可能生物膜在陶粒表面已初步形成，從而加快了氧化速率。為驗證細(xì)菌是否形成生物膜，從第2次開始，只添加培養(yǎng)基未添加菌液，隨著培養(yǎng)液更換次數(shù)的增加，反應(yīng)器內(nèi)細(xì)菌氧化等量Fe2+的速率也逐步增大，至第8次開始穩(wěn)定在3 h左右。表明陶粒表面生物膜逐漸生成，膜內(nèi)細(xì)菌的生長和繁殖隨之加快，并且從第8次起，細(xì)菌在生物膜內(nèi)生長和繁殖開始趨于穩(wěn)定，氧化Fe2+的速率穩(wěn)定在0.33 g/(Lh)左右。

圖7 生物陶粒表面掛膜前后SEM圖像

從圖7(a)可知，生物陶粒表面比較粗糙，分布著不規(guī)則的紋理狀結(jié)構(gòu)和發(fā)育良好的孔隙，這為A.ferrivorans的附著提供了充足的場所，對比圖7(a)，從圖7(b)可以看出，生物陶粒表面形成了較厚且不均勻的生物膜，生物膜上可見利于細(xì)菌代謝產(chǎn)物排出和營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入的微孔[24-25]，這些微孔也為細(xì)菌進(jìn)出生物膜提供了通道。

3.6 固定化細(xì)菌與游離態(tài)細(xì)菌氧化Fe2+活性對比

通過固定化細(xì)菌與游離態(tài)細(xì)菌氧化速率對比試驗，進(jìn)一步驗證A.ferrivorans生物膜形成后氧化Fe2+的效果，結(jié)果見圖8。

從圖8可知，A培養(yǎng)液中Eh上升的速度和細(xì)菌氧化速率明顯高于B培養(yǎng)液,表明固定化細(xì)菌和游離態(tài)細(xì)菌協(xié)同氧化Fe2+的速率高于游離態(tài)細(xì)菌單獨氧化的速率，即A.ferrivorans在生物陶粒上進(jìn)行固定化培養(yǎng)有利于加快Fe2+的氧化速率，有助于解決以往細(xì)菌浸鈾過程中Fe2+氧化速率較慢的問題。

4 結(jié) 論

(1)接種量對A.ferrivorans的緩慢生長期影響較小，考慮時間和經(jīng)濟(jì)成本，A.ferrivorans的接種量宜為10%左右；Fe2+的初始濃度為0.3～0.5 g/L時，對細(xì)菌的生長活性影響較小，表明吸附尾液中Fe2+含量為0.3～0.5 g/L能滿足A.ferrivorans較快生長繁殖。

圖8 A.ferrivorans固定化培養(yǎng)后氧化Fe2+速率對比試驗

(2)溫度為5～25 ℃時，A.ferrooxidans的最大氧化速率為0.018 g/(Lh)，A.ferrivorans為0.024 g/(Lh)，與A.ferrooxidans相比，A.ferrivorans更適應(yīng)新疆酸法地浸鈾礦山尾液的低溫環(huán)境。

(3)A.ferrivorans經(jīng)多次耐酸馴化，細(xì)菌能在高酸(pH=0.31)培養(yǎng)液中保持較好的生長活性，滿足現(xiàn)場生產(chǎn)工藝要求。

(4)A.ferrivorans經(jīng)過多次固定化培養(yǎng)，陶粒表面生物膜逐漸生成，氧化Fe2+速率持續(xù)加快，最大氧化速率達(dá)到0.33 g/(Lh)，固定化細(xì)菌和游離態(tài)細(xì)菌協(xié)同氧化等量Fe2+的速率是游離態(tài)細(xì)菌單獨氧化的3.4倍，A.ferrivorans在生物陶粒上的固定化，大幅提高了氧化Fe2+的速率。

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