趙娜娜，劉?匯，孫道磊，梁新合，張?輝*，孫佳明*

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.延邊朝鮮族自治州食品藥品檢驗所，吉林 延吉 133002；3.云南白藥集團中藥資源有限公司，昆明 650100；4.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春 130117）

血塞通軟膠囊是以五加科人參屬植物三七提取的有效部位三七總皂苷為原料制成的膠囊制劑，具有活血祛瘀，通經(jīng)活絡(luò)，抑制血小板聚集和增加腦血流量的作用，用于中風(fēng)偏癱、腦梗死、腦栓塞等瘀血阻絡(luò)證者[1]。臨床上，血塞通常與阿司匹林、依達拉奉、奧扎格雷等[2-4]西藥聯(lián)合應(yīng)用，治療腦梗死療效顯著。三七的主要活性成分為人參皂苷Rb1、Rd、Rg1和三七皂苷R1等在內(nèi)的三七總皂苷，其在血液系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等多方面具有廣泛藥理活性[5-6]。實驗研究表明[7-8]，人參皂苷Rb1通過上調(diào)GFAP的表達，能夠增加局部腦血流量，保護缺血半暗帶神經(jīng)元，且作用與尼莫地平相當(dāng)，可在一定程度上改善腦缺血；三七皂苷R1對大鼠腦缺血再灌注損傷具有保護作用等。本研究通過SPE-ESI-MS/MS法為快速分析血塞通中有效成分三七總皂苷單體提供了有效方法，同時也為以三七總皂苷成分為原料的藥品質(zhì)量控制方法研究提供了參考依據(jù)。

1 實驗材料和方法

1.1 儀器與試劑 Agilent SampliQ C18固相萃取柱，Waters Oasis HLB固相萃取柱，Agilent 6320 Lion Trap MS 質(zhì)譜儀，GL-20-Ⅱ型低溫離心機，BPZ110型十萬分之一電子分析天平，HS2060超聲波清洗器，甲醇、乙醇為分析純，實驗用水為娃哈哈純凈水。血塞通軟膠囊為昆明圣火藥業(yè)（集團）有限公司。

1.2 供試品提取 取血塞通試樣準(zhǔn)確稱量0.80 g，放入100 mL具塞三角燒瓶中，加入10 mL甲醇，進行超聲提取40 min后離心8 min，轉(zhuǎn)速為12 000 r/min，吸取上層清液放入50 mL梨形瓶中進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，水浴溫度設(shè)定為50 ℃，濃縮至近干后，取4 mL水置于梨形瓶中將殘渣進行充分溶解，然后吸取全部溶液至試管中，固相萃取備用。

1.3 固相萃取柱凈化 首先分別用4 mL甲醇、4 mL水將固相萃取柱進行活化，然后將準(zhǔn)備好的試樣溶液加入活化好的固相萃取柱中，再依次用4 mL水進行淋洗，4 mL 50%甲醇水溶液進行洗脫，收集洗脫液，用0.45 μm微孔濾膜進行過濾，收集的續(xù)濾液供電噴霧質(zhì)譜分析用。

1.4 電噴霧質(zhì)譜條件 電噴霧正離子化（ESI+）檢測；掃描范圍50～1 400 m/z；噴霧電壓3 000 V；霧化氣壓40 psi；毛細管溫度350 ℃。

2 實驗結(jié)果

通過實驗條件優(yōu)化選擇了最佳實驗條件和方法對血塞通試樣進行了分析、檢測，根據(jù)電噴霧質(zhì)譜分析準(zhǔn)分子離子峰及二級質(zhì)譜碎片信息，并參考相關(guān)文獻[9-12]進行解析，鑒定了血塞通中三七總皂苷6種常見的皂苷類成分，為人參皂苷Rb1、Rc、Rd、Rg1、 Rh1和三七皂苷R1。電噴霧質(zhì)譜結(jié)果見圖1，二級質(zhì)譜碎片特征見表1。

圖1 血塞通中皂苷類化學(xué)成分的電噴霧質(zhì)譜圖

表1 血塞通中皂苷類化學(xué)成分的ESI-MS/MS分析結(jié)果

3 討論

3.1 樣品提取方法的優(yōu)化 本實驗樣品提取方法為超聲提取方式，通過考察不同提取溶劑和提取時間優(yōu)化提取方法。通過采用甲醇、乙醇、水3種不同提取溶劑進行萃取，實驗結(jié)果表明，以甲醇為提取溶劑的效果好。再以相同條件下分別用10 min、20 min、40 min、60 min4個不同提取時間進行提取，發(fā)現(xiàn)40 min的提取效率和60 min的提取效率基本相同，且能夠?qū)悠烦煞痔崛⊥耆?。因此，本實驗最終選擇使用甲醇做提取溶劑進行超聲提取40 min。

3.2 固相萃取柱的選擇 本實驗采用了Angillent SampliQ C18SPE柱和Waters Oasis HLB固相萃取柱進行實驗對比，發(fā)現(xiàn)Angillent SampliQ C18SPE柱萃取和凈化的效果更好，皂苷在C18SPE柱表現(xiàn)出良好的反相色譜保留行為。

3.3 固相萃取淋洗液和洗脫液的選擇 為得到更好的淋洗效果，本實驗考察了不同濃度（10%～100%）的甲醇水溶液做為淋洗液，電噴霧質(zhì)譜分析結(jié)果表明，甲醇濃度越高的淋洗液，對皂苷的洗脫能力越強。當(dāng)選用水溶液作為淋洗液時，皂苷仍將保留在固相萃取柱上，不會被洗脫下來，而血塞通試樣中的水溶性雜質(zhì)可被洗脫下來。因此，選用水溶液作為淋洗液可以去除樣品中的雜質(zhì)干擾并凈化固相萃取柱的固定相。當(dāng)選用50%甲醇水溶液洗脫時，可將皂苷完全洗脫下來，獲得最佳回收率和凈化效果。此外，本實驗考察了不同洗脫體積的洗脫液對實驗的影響，通過實驗結(jié)果分析，洗脫液的體積為4 mL時，皂苷可完全從固相萃取柱上洗脫下來。

3.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 本實驗分別考察了正、負兩種電離模式進行全掃描，采用流動注射泵連續(xù)進樣方式進行質(zhì)譜條件的優(yōu)化。通過質(zhì)譜結(jié)果分析，發(fā)現(xiàn)負離子電離模式下可獲得較高豐度的[M-H]-母離子和較多的分子離子峰數(shù)目，且符合皂苷類化合物的化學(xué)電離性質(zhì)。

據(jù)報道，應(yīng)用薄層色譜對三七為原料的血塞通等中成藥進行定性鑒別時多選用三七皂苷R1、人參皂苷Rb1以及人參皂苷Rg1為對照品[13-14]。鑒于血塞通通過固相萃取-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法獲得的一級質(zhì)譜圖中Rc和Rh1的豐度較高，易于鑒別為三七主要成分，為加強對血塞通的質(zhì)量控制，可在原有常用對照品的基礎(chǔ)上增加了2 個皂苷的檢測指標(biāo)，同時也為以三七皂苷類成分為原料的藥品的質(zhì)量控制方法研究提供參考。

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