陳君，徐孝飛

(1 解放軍第一一七醫(yī)院，浙江杭州 310000；2 杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司)

肺癌是發(fā)病率和病死率增長最快的癌癥 ，如何精準(zhǔn)診斷肺癌成為當(dāng)前世界亟待解決的難題。液體活檢在癌癥中無創(chuàng)傷性早期診斷和實時監(jiān)測的作用給癌癥患者帶來了希望。目前，液體活檢能檢測各種循環(huán)癌癥生物標(biāo)志物，如循環(huán)腫瘤細胞(CTC)、循環(huán)腫瘤DNA、循環(huán)miRNA等。miRNAs是一類內(nèi)源性非編碼的RNA小分子，長度19～25個核苷酸。miRNA首先在核內(nèi)被RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄合成初級miRNA，再由Drosha-DGCR8加工形成60～100 nt莖環(huán)結(jié)構(gòu)前體miRNA，然后被核運輸受體exportin-5和核蛋白Ran-GTP運送至細胞質(zhì)，由Dicer再進一步加工形成25 nt成熟miRNA[1]。miRNA可通過其靶基因調(diào)控下游細胞通路，影響細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡、耐藥等[2]。循環(huán)miRNA可能來源于損傷的組織、凋亡壞死的細胞以及細胞中的微囊泡，它穩(wěn)定存在于血清、血漿等體液中，在腫瘤疾病患者體內(nèi)和正常人的表達存在顯著的差異，因此循環(huán)miRNA可作為腫瘤預(yù)測的生物學(xué)標(biāo)志物。目前，已有很多研究報道，miRNA在血液中檢測可發(fā)揮疾病診斷、患者預(yù)后評估、治療反饋的功能。

1 血液中循環(huán)miRNA的檢測技術(shù)

在肺癌中，循環(huán)miRNA檢測樣品主要是血漿或血清，由于樣品體積少，miRNA在血清或血漿中含量不高，后續(xù)選擇適合的檢測技術(shù)尤為重要。McDonald等[3]報道循環(huán)miRNA在血漿或血清中比較穩(wěn)定，但由于紅細胞內(nèi)也存在大量miRNA，血液樣品不及時處理會受到溶血影響，導(dǎo)致檢測結(jié)果精確度不夠，因此選擇參照標(biāo)準(zhǔn)化時，采用外源添加的cel-miRNA-39-3p作為外參。另外，Guo等[4]專門比較了5種血清循環(huán)miRNA提取試劑盒(Qiagen Circulating Nucleic Acid Kit，ThermoFisher Scientific Ambion TRIzol LS Reagent，Qiagen miRNEasy，QiaSymphony RNA extraction kit和Exiqon MiRCURY RNA Isolation Kit)提取小RNA的質(zhì)量，Qiagen Circulating Nucleic Acid Kit獲取的miRNA變異性最佳，但Ambion TRIzol LS Reagent提取獲得的miRNA閱讀數(shù)百分比最高，各個提取試劑盒均有優(yōu)劣。

檢測循環(huán)miRNA的常規(guī)方法一般有兩種，基因芯片表達譜和PCR檢測。基因芯片表達譜檢測用于高通量篩選差異miRNA，PCR檢測則進一步驗證選定的miRNA是否有效。經(jīng)實驗比較，對于血液中的miRNAs檢測，基于Q-PCR平臺的芯片(TaqMan ABI，miRCURY Exiqon)敏感性更高，而在血漿中低表達的miRNA，miRCURY的敏感性和準(zhǔn)確性優(yōu)于TaqMan平臺[5]。PCR檢測又細分為Q-PCR和ddPCR，但Q-PCR和ddPCR兩種方法檢測出來的肺癌循環(huán)miRNA結(jié)果并沒有很大區(qū)別[6]。此外，Gao等[7]研發(fā)了一種利用硅鈉米線場效應(yīng)的生物傳感器，可同時檢測miRNA-126和癌胚抗原的表達水平。

2 循環(huán)miRNA在肺癌中的診斷價值

肺癌主要分為非小細胞肺癌(NSCLC)和小細胞肺癌(SCLC)兩大基本類型，NSCLC又包括鱗狀細胞癌、腺癌和大細胞癌。目前，在各類肺癌中都有文獻報道循環(huán)miRNA可作為診斷指標(biāo)。

Shang等[8]發(fā)現(xiàn) miR-22在鱗癌患者血漿中表達高于正常人，miR-126在腺癌患者血漿中表達低于正常人，并且這兩個miRNA預(yù)測NSCLC發(fā)生的受試者工作特征曲線(ROC)中曲線下面積(AUC)均大于0.8，另外關(guān)于NSCLC轉(zhuǎn)移的ROC中AUC均大于0.7。Wang等[9]選取118例早期肺癌患者，48例中晚期肺癌患者和135例健康人血清進行探針預(yù)測miRNA和Q-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)miR-125a-5p、miR-25和miR-126聯(lián)合診斷較為準(zhǔn)確，AUC在診斷早期肺癌時已達0.936。因此，多個miRNA作為生物標(biāo)志物來診斷肺癌發(fā)生，靈敏度和特異度高于單個miRNA，有更好的診斷精確性。

miRNA還可以和某些基因或蛋白聯(lián)合診斷肺癌發(fā)生。Roth等[10]通過35例NSCLC患者和7例良性肺部腫瘤患者以及28例正常人的血清比較，發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清中半胱天冬酶活性比正常人高,但又比良性肺部腫瘤患者低，還發(fā)現(xiàn)miR-10b、miR-141、miR-155在NSCLC患者血清中含量高于正常人和良性肺部腫瘤患者，AUC均大于0.7。

3 循環(huán)miRNA在肺癌中的預(yù)后評估價值

Wang等[11]使用全miRNA表達譜芯片測試長生存期(大于24月)NSCLC患者及短生存期(小于6月)患者，分析出140個高表達的miRNA，再通過生物信息學(xué)GO分析和miRNA靶基因預(yù)測數(shù)據(jù)庫，篩選出與TGF-β1信號通路相關(guān)的35個miRNA，進一步用比例風(fēng)險回歸模型分析生存期影響因素，得出17個miRNA與2年生存期有明顯關(guān)聯(lián)。其中miR-16表達在長短生存期中差異最大，長生存期與高表達的miR-16有關(guān)。進行風(fēng)險評分得出，高風(fēng)險分?jǐn)?shù)患者比低風(fēng)險分?jǐn)?shù)患者死亡率增加2.5倍，中位生存率減少7.8個月。

Rui等[12]根據(jù)SCLC能否安全接受放療條件分組，挑選22例局限期(LD)SCLC和50例廣泛期(ED)SCLC患者血清進行miRNA芯片分析。結(jié)果顯示，miR-574-5p等4個miRNA在ED組中高于LD組，而miR-184和miR-4459則是LD組高于ED組。再進一步用45對相應(yīng)的組織和血清進行驗證，體外驗證選用H446和H2227細胞，得出miR-184通過抑制EPAS1基因從而抑制Wnt/β-catenin通路活性抑制SCLC轉(zhuǎn)移侵襲，miR-574-5p抑制PTPRU基因激活Wnt/β-catenin通路促進SCLC轉(zhuǎn)移侵襲。另有研究表明，miR-574-5p在A549、PC-9等NSCLC細胞中同樣具有抑制PTPRU基因激活Wnt/β-catenin通路促進細胞遷移侵襲作用，但是miR-574-5p表達高低在75例患者無進展生存期(PFS)和總生存率(OS)上差異并沒有統(tǒng)計學(xué)意義，并不是NSCLC預(yù)后因子[13]。SCLC和NSCLC中預(yù)后相關(guān)miRNA雖然可能具有同樣的生物學(xué)功能，但臨床上并不能通用。

4 循環(huán)miRNA在肺癌中的治療反饋功能

在放療方面，Sun等[14]通過80例Ⅱ～Ⅲ期接受放療局部晚期NSCLC患者血清miRNA表達譜檢測，篩選出11個miRNA預(yù)測放療劑量增減對OS的影響，建立了一種劑量反饋評分(DRS)的算法，可有效預(yù)測高劑量和標(biāo)準(zhǔn)劑量治療后患者的OS。低DRS的患者中，高劑量放療與標(biāo)準(zhǔn)劑量放療相比顯著改善OS，且大劑量放療也能降低遠處轉(zhuǎn)移和局部進展的風(fēng)險。高DRS患者高劑量放射治療和標(biāo)準(zhǔn)劑量放療在OS上相似。

在化療方面，Li等[15]從60例NSCLC患者和30例正常人的血清miRNA比較中發(fā)現(xiàn),miR-210表達升高可作為NSCLC診斷依據(jù)，且根據(jù)36例接受2～3次鉑類化療的晚期NSCLC患者的療效反饋分析，穩(wěn)定和疾病進展組患者比局部緩解組患者血清miR-210表達更高。Shi等[16]重點關(guān)注ⅢB期和Ⅳ期肺腺癌患者(無EGFR基因和ALK基因突變)培美曲塞聯(lián)合順鉑一線治療后單用培美曲塞維持治療情況，通過76例培美曲塞維持治療組和72例只接受最佳支持治療的觀察組患者血清miRNA譜比較發(fā)現(xiàn)，高表達miR-145、低表達miR-25和miR-210的培美曲塞維持治療人群具有較長的PFS。

在靶向藥物方面，Shen等[17]通過60例表皮生長因子受體(EGFR)突變患者和68例EGFR未突變患者血清miRNA表達譜檢測發(fā)現(xiàn),miR-21可作為吉非替尼治療反饋的預(yù)測因子，吉非替尼治療后降低了miR-21表達，患者獲得了更長的OS。此外，miR-10b在EGFR突變患者血清中含量高于未突變患者，且在進展期表達高于疾病完全緩解或疾病穩(wěn)定期，但miR-10b表達與EGFR是否突變沒有相關(guān)性。

程序性死亡受體1(PD-1)和程序性死亡受體-配體1(PD-L1)是最近癌癥免疫治療的熱點，目前還未有循環(huán)miRNA在PD-1或PD-L1治療前后的臨床血液miRNA監(jiān)測數(shù)據(jù)，但有文獻表明，miR-200家族、miR-34NA家族和miR-197在肺癌NSCLC細胞中與PD-L1有一定相關(guān)性[18]。

5 展望

目前，關(guān)于一些miRNA在血液中各組分中是否有表達已有相關(guān)數(shù)據(jù)庫(http://134.245.63.235/ikmb-tools/bloodmiRs)可查詢，但這些miRNA仍不全面，未能獲知miRNA在肺癌臨床中發(fā)揮了何作用。因此，我們?nèi)孕柽M一步試驗歸納，獲得不同肺癌種類的最佳預(yù)測、預(yù)后、治療反饋功能特殊miRNA，用來作為生物標(biāo)志物，以達到精準(zhǔn)治療的目的。

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