楊芳，王欣，苑永輝，黃居梅，郭瑞娟

(1 山東省地方病防治研究所，濟南250014；2中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院·遼寧省腫瘤醫(yī)院)

原發(fā)性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年新發(fā)病例約60萬，居世界惡性腫瘤第五位，我國肝癌的死亡數(shù)占全球的55%，其發(fā)病率與病死率分別高居第四及第三位[1,2]。大量研究表明，鞘氨醇激酶與體內(nèi)脂質(zhì)代謝密切相關(guān)，參與細胞的增殖、分化及凋亡[3]。鞘氨醇激酶-1(SphK1)可以起到增強癌細胞活力、促進腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用[4,5]。2016年10月～2017年6月，本研究篩選了SphK1的高表達株，并觀察了SphK1拮抗劑對其高表達株細胞增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 正常肝細胞系L02和肝癌細胞系HepG2、Huh7、Bel7402購自于中國科學(xué)院上海細胞生物研究所。DMEM培養(yǎng)液、RPMI1640培養(yǎng)液購自于Hyclone公司。胎牛血清購自于Gibco公司。TRIzol、PrimeScript RT Reagent Kit、Perfect Real Time和SphK1引物均購自TAKARA公司。細胞增殖-毒性檢測試劑盒購自日本Dojindo公司。PF-543購自Selleck公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 在5%C02、37 ℃條件下，L02、HepG2細胞置于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)；Huh7、Bel7402細胞置于含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，2～3 d更換一次新鮮培養(yǎng)液，待細胞融合至80%，用0.25%胰酶消化傳代后接種于6孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔，選對數(shù)生長期的細胞用于試驗。

1.3 組織SphK1的檢測 采用RT-PCR法。應(yīng)用TRIzol提取RNA，按說明書要求操作。以紫外分光光度計檢測RNA濃度。按PrimeScript RT Reagent Kit試劑盒方法進行RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為20 μL。使用Roche 480Ⅱ熒光定量PCR儀進行PCR擴增及結(jié)果分析。取反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 2 μL作為模板，按照試劑盒的說明，配制反應(yīng)體系進行擴增，SphK1引物F：5′-GGGGAATTGATGGTTAGCG-3′，R：5′-AGGAAGGGTCCTGACAGTAGAT-3′，片段長度：179 bp，退火溫度為58 ℃；GAPDH引物F：5′-CCACTAGGCGCTCACTGTT-3′，R：5′-TGGAATTTGCCATGGGTGGA-3′，片段長度：228 bp，退火溫度為59 ℃。反應(yīng)體系為20 μL。以GAPDH為內(nèi)參RNA。目的基因的相對量通過2-ΔΔCt法來計算。以上實驗均以不含cDNA的體系為陰性對照。

1.4 細胞增殖活力的檢測 采用CCK-8法。取HepG2細胞，PBS清洗，胰蛋白酶消化，制成細胞懸液。按每孔500個接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，加入含0.5% FBS的培養(yǎng)液預(yù)處理24 h，以達到細胞同步化。實驗分為5組： 10-7、10-6、2.5×10-6、10-5mol/L PF-543組及空白組，實驗組按100 μL/孔加入含藥培養(yǎng)液，每組設(shè)6個復(fù)孔，空白組加入等量含0.5% FBS的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，細胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。使用酶標儀于450 nm處測OD值。

2 結(jié)果

2.1 SphK1在肝癌細胞系中的表達 HepG2細胞中SphK1的表達量最高，是正常肝細胞L02中SphK1表達量的(3.28±0.64)倍，兩者比較，P<0.01；Huh7細胞中SphK1的表達量是正常肝細胞L02中SphK1表達量的(2.07±0.26)倍，兩者比較，P<0.01，BEL7402細胞中SphK1的表達量最低，是正常肝細胞L02中SphK1表達量的0.22±0.04，兩者比較，P<0.01。

2.2 不同濃度PF-543對HepG2細胞增殖活力的影響 預(yù)處理72 h后，10-7、10-6、2.5×10-6、10-5mol/L PF-543組及空白組OD450值分別為1.03±0.06、0.82±0.08、0.67±0.05、0.43±0.05、1.03±0.07。10-6、2.5×10-6、10-5mol/L的PF-543組均低于空白組(P均<0.01)，10-7mol/L PF-543對HepG2細胞未見明顯影響。PF-543在10-6、2.5×10-6、10-5mol/L濃度范圍內(nèi)對HepG2細胞增殖的抑制呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)。

3 討論

原發(fā)性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生與細胞內(nèi)復(fù)雜的分子機制密切相關(guān)，找到與肝癌發(fā)生、發(fā)展起關(guān)鍵作用的靶點是腫瘤治療的關(guān)鍵所在。

近年研究表明,鞘脂在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮極為重要的作用，是細胞生物學(xué)功能的重要調(diào)控子。重要的鞘脂類分子如神經(jīng)酰胺(Cer)和鞘氨醇(Sph)有促細胞凋亡和抑制細胞增殖的作用；鞘氨醇-1-磷酸(S1P)既可作為細胞內(nèi)第二信使發(fā)揮作用，又可與細胞表面的特定受體結(jié)合而調(diào)節(jié)細胞的增殖、凋亡、遷移及黏附分子表達等[6]。S1P/Cer的平衡是決定細胞生存或凋亡的重要因素。在 S1P生物合成過程中，Cer/Sph與S1P之間形成“鞘脂變阻器”，決定細胞的存活或死亡,而SphKs是Cer/Sph與S1P平衡的重要調(diào)控分子，起關(guān)鍵限速作用[7,8]。

目前，在人類和小鼠組織中已發(fā)現(xiàn)有SphK1和SphK2兩種異構(gòu)體存在，其中SphK1是細胞調(diào)節(jié)S1P生成的最主要分子，與多種腫瘤細胞的過度增殖有關(guān)[9]。SphK1對于維持正常細胞周期必不可少，SphK1表達增加不僅導(dǎo)致S1P水平升高，能對抗細胞凋亡，還能增加細胞周期由G1期向S期轉(zhuǎn)化的速率[10]。Kohno等[11]研究發(fā)現(xiàn)，SphK1活化能夠促進小腸腺瘤細胞增殖，抑制SphK1活性可抑制小腸癌的發(fā)生。Zhao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，抑制SphK1的表達可以降低頭頸部鱗狀細胞癌的生長速度。但其在肝癌中的研究尚不明確。

為了探索SphK1在肝癌中的作用，我們選取正常肝細胞及三種肝癌細胞系作為模型進一步研究。本實驗首先從RNA水平檢測SphK1在正常肝細胞L02、肝癌細胞HepG2、Huh7、Bel7402中SphK1的表達量，證實SphK1在HepG2細胞系中的表達量高于其他細胞系，篩選出HepG2細胞系是SphK1高表達株；并進一步采用CCK-8法觀察不同濃度SphK1拮抗劑PF-543對HepG2細胞增殖能力的影響，結(jié)果顯示SphK1拮抗劑PF-543可劑量依賴性地抑制HepG2細胞增殖。

綜上所述，HepG2細胞系是SphK1高表達株，在研究SphK1與肝癌的發(fā)生機制中，HepG2細胞系是首選細胞系。SphK1拮抗劑PF-543可顯著性抑制HepG2細胞增殖，提示SphK1可能成為肝癌治療的一個潛在靶點。

參考文獻：

[1] Torre LA, Bray F, Siegel RL, et al. Global cancer statistics, 2012 [J]. CA Cancer J Clin, 2015,65(2):87-108.

[2] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015 [J]. CA Cancer J Clin, 2016,66(2):115-132.

[3] Pappu R, Schwab SR, Cornelissen I, et al. Promotion of lymphocyte egress into blood and lymph by distinct sources of sphingosin-1-phosphate[J]. Science, 2007,316(5822):295-298.

[4] Heffernan-Stroud LA, Obeid LM.Sphingosine kinase 1 in cancer[J]. Adv Cancer Res, 2013,117:201-235.

[5] Gao Y, Gao F, Chen K, et al. Sphingosine kinase 1 as an anticancer therapeutic target[J]. Drug Des Devel Ther, 2015,9:3239-3245.

[6] Pyne NJ, Ohotski J, Bittman R, et al. The role of sphingosine 1-phosphate in inflammation and cancer[J]. Adv Biol Regul， 2014,54:121-129.

[7] Pyne S, Adams DR, Pyne NJ. Sphingosine 1-phosphate and sphingosine kinases in health and disease: recent advances[J]. Prog Lipid Res， 2016,62:93-106.

[8] Selvam SP, Ogretmen B. Sphingosine kinase/sphingosine 1-phosphate signaling in cancer therapeutics and drug resistance[J]. Handb Exp Pharmacol， 2013(216):3-27.

[9] Hatoum D, Haddadi N, Lin Y, et al. Mammalian sphingosine kinase (SphK) isoenzymes and isoform expression: challenges for SphK as an on cotarget [J]. Oncotarget， 2017,8(22):36898-36929.

[10] Yu H, Shao Y, Gao L, et al. Acetylation of sphingosine kinase 1 regulates cell growth and cell-cycle progression[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2012,417(4):1242-1247.

[11] Kohno M, Momoi M, Oo ML, et al. Intracellular role for sphingosine kinase 1 in intestinal adenoma cell proliferation[J]. Mol Cell Biol, 2006,26(19):7211-7223.

[12] Zhao Y, Ling Z, Hao Y, et al. MiR-124 acts as a tumor suppressor by inhibiting the expression of sphingosine kinase 1 and its downstream signaling in head and neck squamous cell carcinoma[J]. Oncotarget, 2017,8(15):25005-25020.