彭邦劍，黃文斌，趙娟娟，潘明新

(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院，廣州 510280)

肝細胞癌(HCC)是臨床最常見的惡性腫瘤之一，多數(shù)患者就診時已處于中晚期，錯過了根治性手術(shù)的最佳時機，即使可行手術(shù)治療，術(shù)后也極易復發(fā)，預后較差。早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療可明顯提高HCC患者的生存時間和生存質(zhì)量。甲胎蛋白(AFP)作為HCC最經(jīng)典的血清腫瘤標志物，已在臨床上普遍使用，但其敏感性和特異性都不令人滿意。因此，尋找敏感、特異的腫瘤標志物一直臨床研究的熱點。循環(huán)腫瘤細胞(CTCs)是存在于外周血循環(huán)中各類腫瘤細胞的統(tǒng)稱，可自發(fā)或因診療操作從實體腫瘤病灶(原發(fā)灶、轉(zhuǎn)移灶)脫落。大部分CTCs在進入外周血后發(fā)生凋亡或被吞噬，只有極少數(shù)腫瘤細胞在循環(huán)系統(tǒng)中存活下來。由于其在人體外周血中含量極少，在大量的血細胞中富集并鑒定出這一類特殊細胞非常困難。目前主要通過物理特性或生物學特性等從外周血中富集CTCs，富集到的CTCs再經(jīng)免疫熒光標記法、RNA原位雜交法、流式細胞術(shù)、細胞的核質(zhì)比例法進一步排除非CTCs?，F(xiàn)已證實，CTCs在肝癌、乳腺癌、肺癌等腫瘤血行轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[1]。本文結(jié)合文獻就HCC中CTCs的檢測技術(shù)及其臨床應用研究進展作一綜述。

1 HCC外周血中CTCs檢測技術(shù)

CTCs在腫瘤患者外周血中含量極少，即使在已知的轉(zhuǎn)移性腫瘤患者外周血中也存在很少，故從大量血細胞中富集并鑒定出這一類特殊細胞非常困難。目前，臨床上可用于富集CTCs的技術(shù)近百余種，其原理主要是基于CTCs的物理特性和生物學特性，但均無法避免血細胞污染。要進一步明確CTCs與腫瘤生物學的關(guān)系，避免其他細胞的影響，必須對富集的CTCs進行鑒定。目前常用的鑒定方法主要有基于免疫熒光標記法、RNA原位雜交法、流式細胞術(shù)、細胞的核質(zhì)比例法等。

1.1 CTCs富集技術(shù) 基于CTCs物理特性的技術(shù)主要集中在尺寸大小、可塑性、密度梯度或介電性質(zhì)等方面。由于CTCs密度比紅細胞、中性粒細胞小，依據(jù)這一特性，通過密度梯度離心的方法分離外周血中不同的細胞組分，這是早期分離CTCs的方法，目前已很少單獨使用該方法富集CTCs。商業(yè)化產(chǎn)品CanpatrolTM系統(tǒng)、ISET?系統(tǒng)和ScreenCell?系統(tǒng)等利用具有一定大小孔徑的微孔濾膜富集CTCs，由于白細胞尺寸偏小且容易形變，能通過微孔被去除，而CTCs尺寸較大且細胞骨架較硬，不易形變，很難通過濾膜而被截留下來。Qi等[2]通過CanpatrolTM系統(tǒng)從112例HCC患者(包含早期HCC)外周血中富集CTCs，其中111例患者富集到CTCs。ApoStream?系統(tǒng)是利用電介質(zhì)的差異來富集CTCs，其在血液中捕獲腫瘤細胞的效率超過75%，其捕獲的MDA-MB-231細胞的存活率高于97.1%，并且培養(yǎng)至第7天時細胞生長沒有差異。由于根據(jù)物理特性篩選CTCs易混雜其他血細胞，并且可能會遺漏掉部分腫瘤細胞，目前采用物理特性的方法富集CTCs的研究越來越少。

在生物學特性中，大多數(shù)方法是基于免疫親和性，如免疫磁珠富集法、流式細胞術(shù)分選等。免疫磁珠富集法是指依靠細胞表面標志物，將抗體包被在磁珠表面成為免疫磁珠，主要分為正向富集和負向富集。CellSearch?系統(tǒng)采用正向富集的策略，基于上皮細胞黏附分子(EpCAM)陽性CTCs，將腫瘤細胞上皮標志物EpCAM抗體包被在磁珠表面，通過EpCAM抗體特異結(jié)合在CTCs表面，在外加磁場的作用下分選出CTCs。Sun等[3]采用CellSearch?系統(tǒng)對73例接受HCC手術(shù)患者進行CTCs分布模式研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在外周靜脈血、外周動脈血、肝靜脈、肝后下腔靜脈和門靜脈中富集到CTCs的患者比例分別為68.49%、45.21%、80.82%、39.72%和58.90%。負向富集是通過剔除血細胞的方法來分選CTCs。Guo等[4]采用負向富集的方法結(jié)合多標志物組合模型對60例HCC患者外周血進行觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)術(shù)后1個月患者外周血CTCs明顯下降。表明CTCs模型在HCC診斷中具有較高的敏感性和特異性，可作為風險預測和治療監(jiān)測的實時參數(shù)。此外，隨著流式細胞術(shù)分選技術(shù)的發(fā)展，其也逐漸被用于CTCs富集。有研究發(fā)現(xiàn)，流式細胞分選技術(shù)檢測CTCs在體外是可行的，并與RT-PCR檢測結(jié)果一致，但其在體內(nèi)檢測敏感性較差，與RT-PCR檢測結(jié)果不一致，這使流式細胞術(shù)單獨應用于CTCs富集受到了限制。但流式細胞術(shù)聯(lián)合其他富集技術(shù)在CTCs提純方面具有較好的效果，為進一步在形態(tài)學、細胞學、遺傳學等方面分析CTCs提供了基礎(chǔ)[5]。D′Avola等[6]描述了一種結(jié)合成像流式細胞儀和單細胞RNA測序(scRNA-seq)來識別患者CTCs的方法，其利用CD45陰性富集去除白細胞，然后使用IFC選擇CTCs，最后進行scRNA-seq，該系統(tǒng)捕獲效率高達65%，并且該系統(tǒng)獲得的CTCs基因表達譜存在明顯異質(zhì)性，這或許可為個性化檢測CTCs以及制定相關(guān)治療方案提供新方法。但到目前為止，基于EpCAM的CellSearch?系統(tǒng)仍然是惟一一個獲得FDA(2004年獲批)和CFDA(2012年獲批)批準,用于惡性腫瘤檢測CTCs的商業(yè)化產(chǎn)品。

微流控芯片技術(shù)富集CTCs需要極少的血液數(shù)量，無論是基于物理特性還是生物學特性，均具有較高的敏感性，近年來受到越來越多關(guān)注。當外周血細胞流過微流控芯片時，目標抗體陽性的CTCs將會停留下來。有研究將配體-受體結(jié)合測定應用于微流體裝置中的CTCs芯片，其在人造CTCs血液樣品中的捕獲率超過85%，在36例HCC患者中檢測到的CTCs為(14±10)個/2 mL[7]。Qin等[8]開發(fā)了一種新型簡單的楔形微流體裝置，用于高效分離癌癥患者血液樣本中的CTCs，該方法對HepG2、SKBR3、A549、BGC823四種肝癌細胞表現(xiàn)出優(yōu)異的分離性能(超過85%的捕獲效率)；在臨床試驗中，該平臺鑒定的HCC患者外周血CTCs陽性率為83.3%。類似地，HB Chip、GEM Chip和GO Chip通過設計微管道的結(jié)構(gòu)，并在管道上包被EpCAM抗體，當外周血流經(jīng)包被有EpCAM抗體的管道時，CTCs被捕獲并固定在芯片表面上。目前，采用多種抗體組合模型的微流控芯片技術(shù)用于富集HCC患者外周血CTCs已經(jīng)成熟，這種方法有能力去捕獲那些EpCAM低表達或者不表達的CTCs，但這種方法必須找到合適的標志物區(qū)別于非CTCs，才能被臨床應用。此外，Kalinich等[9]介紹了一種高通量微流體的CTC-iChip，它能有效地從血液標本中消耗造血細胞，并為CTCs提供保存完好的RNA，可為后續(xù)下游形態(tài)學、免疫細胞學和遺傳學等研究提供完整的細胞結(jié)構(gòu)。

CTCs富集技術(shù)多種多樣，無論是基于物理特性還是生物學特性，都不能很好地解釋遺漏CTCs或者白細胞污染的問題，多重富集技術(shù)的組合模型可能是未來的一條出路，但要如何將這些技術(shù)規(guī)范化、正規(guī)化是一個難點，相信不久的將來會有更多新的CTCs富集方法或者組合模型出現(xiàn)，為后續(xù)的CTCs與HCC轉(zhuǎn)移復發(fā)等機制的研究開辟新的道路。

1.2 鑒定技術(shù) 免疫熒光標記是最常用的一種CTCs鑒定技術(shù)，該技術(shù)主要基于細胞抗原-抗體反應來將CTCs區(qū)別于其他細胞，故合適的熒光抗體或熒光抗體組合是關(guān)鍵。CellSearch?系統(tǒng)是使用該方法對CTCs進行鑒定，在這個平臺上，通過使用一種核內(nèi)染色劑(DAPI)來進行免疫組化染色，其中的熒光抗體可特異性反向結(jié)合CD45，也可與CK8、CK18、CK19(細胞質(zhì)上皮標志物)結(jié)合。但有研究發(fā)現(xiàn)，CTCs在脫離腫瘤組織進入血液進行遠處轉(zhuǎn)移的過程中，會發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。與其他上皮性腫瘤不同，大部分HCC細胞并不表達EpCAM，這在一定程度上限制了基于EpCAM技術(shù)在臨床上的應用。Liu等[10]使用一種基于磁珠負性富集的方法去除CD45+白細胞，并改進了識別CTCs的標志物，該團隊應用三種組合抗體——CD45-、去唾液酸糖蛋白受體(ASGPR)和氨基甲酰磷酸合成酶1(CPS1)來標記HCC外周血CTCs，最后采用三重免疫熒光染色處理的方法，將目標細胞分選出來，結(jié)果在91%(29/32)的HCC患者中檢測到了ASGPR和(或)CPS1+CTCs，而在其他腫瘤患者中未檢測到，抗ASGPR和CPS1單克隆抗體的混合物比單獨任一抗體鑒定HCC細胞的敏感性和特異性明顯增加。此外，包括DAPI+、CD45-、ASGPR+、HspPar1+、DAPI+、CD45-、CK+、pERK/Akt+等在內(nèi)的標志物抗體組合也被用于CTCs的鑒定技術(shù)。

通過多重探針標記的RNA原位雜交法實現(xiàn)CTCs鑒定和分型也是常見的鑒定方法之一。Canpatrol系統(tǒng)[11]即是應用這一原理，該系統(tǒng)針對EMT途徑，同時對上皮標志物(如EpCAM、CK8、CK18、CK19)和間質(zhì)標志物(如Twist、Vimentin)進行檢測。有研究表明，在HCC患者外周血中，間質(zhì)型CTCs更多見于出現(xiàn)轉(zhuǎn)移患者的外周血樣本中，并且存在的數(shù)量越多，提示患者預后越差[12]。Qi等[2]應用該系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，112例HCC患者(包含早期HCC)中有111例(90.18%)CTCs陽性；另外，在12例乙型肝炎病毒感染患者中，有2例患者亦檢測到CTCs，這2例患者在5個月內(nèi)均檢測到微小HCC。除了商業(yè)化產(chǎn)品Canpatrol系統(tǒng)外，Guo等[4]對HCC外周血首先采用CD45負性富集，然后利用qRT-PCR的方法對多標記物表征(EpCAM、CD133、CD90和CK19)的CTCs進行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該鑒定技術(shù)在HCC的診斷中具有高度敏感性和特異性，可作為風險預測和治療監(jiān)測的實時參數(shù)。

免疫熒光標記法和RNA原位雜交法是目前常用的兩種CTCs鑒定技術(shù)，但是這兩種技術(shù)都高度依賴相應的標志物，表征CTCs標志物不同將直接導致CTCs鑒定的敏感性和特異性不同。此外，基于流式細胞術(shù)、細胞的核質(zhì)比例法等也有文獻報道。Ogle等[13]首先采用負向富集的方法剔除血細胞，剩下的細胞懸液采用流式細胞成像術(shù)檢測細胞角蛋白、EpCAM、AFP、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3和DNA-PK，然后分析大小、形態(tài)和DNA含量，依此來鑒定HCC外周血CTCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在65.2%的HCC患者血液樣本中檢測到1～1 642個CTCs。Guo等[14]發(fā)現(xiàn)了一種新的策略來檢測HCC外周血CTCs，同樣利用流式細胞儀分選，該系統(tǒng)基于HCC患者外周血細胞的核質(zhì)比例聯(lián)合生物標志物EpCAM和CD45分選CTCs，而不是傳統(tǒng)的單一標志物或者多標志物聯(lián)合檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這個新的CTCs鑒定方法更敏感和更可靠。

CTCs能否預測臨床結(jié)局并進一步評估抗腫瘤藥物的治療效果，最終還要依賴CTCs鑒定技術(shù)是否準確可靠。但至今關(guān)于HCC的CTCs檢測仍然沒有統(tǒng)一標準，其檢測結(jié)果的準確性和可靠性是CTCs在臨床應用中面臨的最大挑戰(zhàn)，不斷提高CTCs檢測技術(shù)并使之規(guī)范化成為了今后研究CTCs的重點。

2 HCC外周血CTCs檢測的臨床應用

目前多種多樣的富集方法和多分子靶標聯(lián)合應用已經(jīng)使得肝癌CTCs的富集與鑒定技術(shù)獲得了較好的敏感性和特異性，在臨床分期、預后評價和療效評估等方面已經(jīng)逐步開展相應的研究并取得了一定成果。

2.1 臨床分期 研究表明，外周血CTCs陽性率及腫瘤分期(BCLC分期、TNM分期)呈正相關(guān)關(guān)系，有肉眼血管侵犯及肝外轉(zhuǎn)移患者體內(nèi)CTCs陽性率更高。Schulze等[15]應用CellSearch?系統(tǒng)檢測HCC外周血發(fā)現(xiàn)，CTCs計數(shù)與患者總生存率、BCLC分期、微血管侵犯、AFP等密切相關(guān)，這與Sun等[1]報道基本一致。CTCs分為上皮型、混合型、間質(zhì)型三種，不同表型的CTCs能從不同方面反映HCC患者臨床特征，可作為評估HCC患者病情的輔助指標。應用CellSearch?系統(tǒng)檢測HCC外周血CTCs時還發(fā)現(xiàn)，在很多TNM分期提示為早期HCC患者外周血中也能檢測到CTCs[8]，這從側(cè)面反映HCC早期即有可能發(fā)展為全身性疾病，僅僅依靠現(xiàn)有的臨床分期不能真實反映HCC的生物學特點。因此，倘若能夠?qū)TCs應用于常規(guī)檢查，如同乳腺癌一樣納入NCCN指南將會有利于HCCs患者的早期診斷，并能監(jiān)測患者預后，進而延長患者的生存期。

2.2 預后判斷 Sun等[1]首次描述了在HCC患者中使用CellSearch?系統(tǒng)檢測EpCAM陽性CTCs，認為術(shù)前CTCs計數(shù)≥2是HCC患者術(shù)后復發(fā)的預測因子。有文獻報道，CTCs計數(shù)與HCC患者不良臨床病理特征相關(guān)，并且可能預示患者預后不良，Sun等[16]的薈萃分析也證實了這一結(jié)論。Wang等[12]采集了62例行根治性切除術(shù)后HCC患者外周血5 mL，采用CanPatrol系統(tǒng)進行分析，發(fā)現(xiàn)切除術(shù)后總CTCs、混合型CTCs和間質(zhì)型CTCs復發(fā)率明顯增高，而上皮型CTCs復發(fā)率沒有差別。Ou等[17]應用CanPatrol系統(tǒng)在根治性手術(shù)前從165例HCC患者獲得外周血樣品檢測CTCs，結(jié)果表明間質(zhì)型CTCs的存在提示最短的無復發(fā)生存率，其次是混合型CTCs，然后是上皮型CTCs，這與Wang等[18]報道基本一致。

2.3 療效評估 CTCs的檢測在評價分期及預后方面已有大量文獻報道，然而在監(jiān)測療效方面相對較少。Shen等[19]評估了EpCAM陽性CTCs計數(shù)在預測不能切除的HCC患者經(jīng)導管動脈化療栓塞后死亡風險，將89例患者分為3組，即低度組(CTCs計數(shù)為0～1)、中度組(CTCs計數(shù)為2～5)和高度組(CTCs計數(shù)≥6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高、中度組死亡風險分別為低度組的2.819(95%CI：1.218～6.526)、1.301倍(95%CI：0.630～2.685)。Guo等[4]對多標記物表征的肝細胞特征CTCs進行大樣本研究，結(jié)果證實其在HCC中具有高度敏感性和特異性，可作為風險預測和治療監(jiān)測的實時參數(shù)，腫瘤切除后CTCs負荷持續(xù)高值患者具有明顯復發(fā)傾向，可早期制定有效的抗腫瘤策略。此外，包括pERK和pAkt，EMT標志物(Twist和波形蛋白)，MAGE-3和生存素，CK、EpCAM和Glypican-3，膜聯(lián)蛋白V、EpCAM、ASGPR1和TAMPs等多標記組合的CTCs檢測也可用于評估轉(zhuǎn)移、預后以及監(jiān)測藥物治療效果。

綜上所述，CTCs分析可能為臨床醫(yī)生和研究人員提供個性化策略，因為CTCs是敏感的生物標志物，有望在早期診斷、預后評價、實時監(jiān)測和藥物耐藥等方面發(fā)揮重要作用，以促進精準醫(yī)學的實施。因此，進一步篩選高存活力、高轉(zhuǎn)移性的肝癌CTCs子集，是深入研究HCC靶向轉(zhuǎn)移機制的關(guān)鍵一步。然而，在臨床上應用CTCs分析前，必須建立一種能夠捕獲全部CTCs高敏感性和特異性的方法。目前，大多數(shù)研究是單中心病例對照研究，樣本量有限，今后需要進行足夠樣本量和長期隨訪的多中心前瞻性研究，以評估CTCs檢測和鑒定方法，以便CTCs更好地用于HCC臨床分期、預后評價和療效評估等。