同重湘，楊增偉 ，常運朝，高愷，吳玲，車團結(jié)*

1，甘肅省傳染病院，甘肅蘭州，730000

2，甘肅省功能基因組與分子診斷重點實驗室，甘肅蘭州，730000

3，甘肅省人民醫(yī)院檢驗科，甘肅蘭州，730000

在 2000 到 2016 年全球范圍內(nèi)，結(jié)核病死亡率下降了 37%。結(jié)核病的預防、控制以及治療挽救了全球 5300 萬人的生命[1]。在 2016，報道全世界結(jié)核病病例有 1040 萬個。其中 620 萬例男性，320 萬例女性，100 萬例兒童。170萬人死于肺結(jié)核，少數(shù)國家肺結(jié)核患者病死率低于 5%，但在非洲地區(qū)肺結(jié)核患者目前診斷傳染性肺結(jié)核的主要方法是通過胸部×片檢查，以及痰涂片染色鏡檢和PPD試驗聯(lián)合檢測。由于胸部×片是根據(jù)臨床癥狀來診斷，缺少病原學依據(jù)，肺結(jié)核和其他肺部疾病在胸片×片的檢查結(jié)果可能有相似之處，導致誤診和漏診；臨床檢測結(jié)果顯示痰涂片抗酸染色方法的陽性率較低，并且標本的不合格導致陽性率更低，容易產(chǎn)生漏診；而PPD試驗的特異性不強，不足以作為肺結(jié)核診斷的依據(jù)。因此這三種檢測結(jié)核分枝桿菌的方法存在較大的缺陷，易導致肺結(jié)核病人的漏診，出現(xiàn)少數(shù)肺結(jié)核病人和其他部位結(jié)核病人的漏診，降低了結(jié)核分枝桿菌檢測的效果[4-6]。

實時熒光定量PCR是一種基因定量檢測手段，使人們獲得了一種從分子水平確定結(jié)核的新途徑，其方法具有快速、簡便、特異性高的特點。研究證明PCR檢測結(jié)核分枝桿菌敏感性可達到99.1%，本研究建立的SYBR Green實時熒光定量PCR法，一種適合于結(jié)核分枝桿菌的快速診斷方法，結(jié)果報告如下。

1 材料與方法

1.1標準菌株結(jié)核分枝桿菌H37Rv ATCC25177，購自上海北思生物科技有限公司。

1.2 樣本確診肺結(jié)核病人培養(yǎng)涂陽的結(jié)核痰液標本113份。正常人的痰液58份。戈登分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌痰液標本共計30份。

1.3主要試劑及儀器Rapid Fungi Genomic DNA Isolation Kit、DNA marker、SYBR@ Premi× E×Taq 、10×loading bufer、SanPrep Column DNA Gel E×traction Kit、pMD Ⅲ 18-T Vector Cloning Kit、SanPrep Column Plasmid Mini-Preps KitDH5α感受態(tài)細胞、10×TBE緩沖液均購自楊凌天潤奧科生物科技有限公司；BL液體培養(yǎng)基購自廣東環(huán)凱生物公司；50mg/mL氨芐西林（Ampicillin，Amp）溶液、LB液體培養(yǎng)基、AmP/LB固體培養(yǎng)基均由實驗室配制；AceQ qPCR SYBR Green Master Mi×購自南京諾唯贊生物科技有限公司；低溫高速離心機購自上海尚道儀器制造有限公司；電熱恒溫水箱購自北京科偉水興儀器有限公司； ASA-9600實時熒光定量 PCR儀購自百源基因技術(shù)有限公司；低溫高速離心機購自江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司；凝膠成像系統(tǒng)購自杭州朗基科學儀器有限公司； ND5000超微量紫外可見分光光度計購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司；微型離心機購自上海民怡儀器儀表有限公司；DYY-8C型電泳儀購自北京六一儀器廠；混懸儀購自美國賽洛捷克；生物安全柜購自上海力申科學儀器有限公司。

1.4 痰液DNA提取吸取待測痰液標本200uL打入2mL的EP管中，加入5mol/L的NaOH 550uL,混勻后室溫中搖動15min。加入1mol/L NaH2PO4750uL，混勻，13680×g離心5min。去上清液，加入200uL的TE，混勻，加入100uL濃度為20mg/mL的溶菌酶。置于37℃消化30min。取1mL消化液加入離心管中，13680×g離心5min。棄上清留沉淀，加入1mL生理鹽水洗滌，13680×g離心5min。棄上清留沉淀，再加入1mL生理鹽水洗滌，13680×g離心5min。留沉淀，加入500uL DNA提取液，混勻，沸水浴10min，13680×g離心5min。取上清2uL點樣上機。

1.5 引物設計與合成查詢 NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫中結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tubercuLosis, M.tubercuLosis）的基因序列分析，找出其特有基因的保守序列設計特異性引物，并且在此區(qū)域應用primer3.0和NCBI中primer-BLAST軟件設計引物及引物分析。M.tubercuLosis Smc 1322F-1570R為外圍引物，M.tubercuLosis Smc 1361F-1462R為SYBR Green實時熒光定量PCR引物，所有引物均由楊凌天潤奧科生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 M.tubercuLosis Smc基因的引物序列Tab.1 The primer sequences of M.tubercuLosis Smc gene

1.6標準陽性質(zhì)粒的構(gòu)建① 以購自上海北思生物科技有限公司的結(jié)核分枝桿菌標準菌株H37Rv ATCC25177為擴增模板，用引物M.tubercuLosis Smc 1322F-1570R進行PCR反應。反應體系為25μL，其中含dNTP 0.5μL，10×PCR buffer 2.5μL，Taq酶0.5μL， F-Primer(10 μmol/L)0.5μL，R-Primer(10 μmol/L)0.5μL，模板DNA 1μL，無菌水19.5μL,反應條件：經(jīng)94℃變性10min；共30個循環(huán)，每次循環(huán)為94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72℃ 30 s；72 ℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物取6μL 進行1.5 %瓊脂糖凝膠電泳，通過凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果，依據(jù)DL2000 Maker鑒定目的片段的大??；②對 PCR產(chǎn)物進按上海生工DNA Gel E×traction Kit說明書進行切膠回收；③pMD18-T Vector與目的回收片段16℃過夜連接，取50μL冰浴上融化的大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，加入目的DNA，輕輕混勻，冰浴中放置30分鐘；42℃水浴中熱激45s，置于冰上2min后加入500μL不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，混勻后37℃，200rpm振蕩培養(yǎng)1小時，取8μL 500mM IPTG和40μL 20mg/mL X-gal混合，均勻地涂在90mm含50μg/mL Amp的平板上，37℃培養(yǎng)箱放置30min。待IPTG和X-gal被吸收后，取200μL菌液涂布在平板上，在37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，挑取白色單克隆，篩選含有目的片段的單克?。虎芴崛≈亟M質(zhì)粒，按照楊凌天潤奧科生物科技有限公司Plasmid Mini-Preps Kit說明書進行操作，將得到的重組陽性質(zhì)粒標準品送至楊凌天潤奧科生物科技有限公司進行測序。

1.7 質(zhì)?？截悢?shù)換算先通過ND5000測定質(zhì)粒DNA的濃度，再根據(jù)質(zhì)粒的分子質(zhì)量將樣品濃度換算為拷貝數(shù)：每μL樣品的拷貝數(shù)=濃度（ng/μL）×阿伏伽德羅常數(shù)×10-9/（重組質(zhì)粒堿基數(shù)×660）= (6.02 x 10(23)) x (ng/ul x 10(-9)) / (DNA length x 660) ，通過計算獲得質(zhì)?？截悢?shù)。

1.8 SYBR Green實時熒光定量PCR反應①用ddH2O將重組陽性質(zhì)粒稀釋至1.0×109copies/μL左右，再依次10倍比稀釋至1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101copies/μL，以這8 個梯度濃度為模板，以M.tubercuLosis Smc 1322F-1570R為上下游引物，通過SYBR Green實時熒光定量PCR擴增，建立標準曲線；②SYBR Green實時熒光定量PCR反應體系為20μL，AceQ qPCR SYBR Green Master Mi× 10μL，模板DNA 1μL，F(xiàn)-Primer（10 μmol/L）0.5μL，R-Primer（10μmol/L）0.5 μL， ddH2O 8 μL。每批反應設立陰性對照均以ddH2O代替模板DNA，反應條件：95℃預變性6min，預變性后進入循環(huán)，每個循環(huán)為95℃ 10s、58℃ 40 s，共35個循環(huán)。將熒光信號采集設在58℃。

1.9 檢測線試驗測定測序正確的重組陽性質(zhì)粒的濃度，換算成拷貝數(shù)。用ddH2O將重組陽性質(zhì)粒標準品稀釋至1.0×109copies/μL左右，依次以1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101copies/μL 8個濃度的質(zhì)粒為模板進行SYBR Green實時熒光定量PCR反應。

1.10 特異性試驗用建立的SYBR Green實時熒光定量PCR法檢測已確診的肺結(jié)核病人結(jié)核痰液標本113份。正常人的痰液標本58份。戈登分枝桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯球菌、痰液標本共計30份的基因組DNA，將全部 PCR產(chǎn)物均送至楊凌天潤奧科生物科技有限公司進行測序，與標準品序列進行比較，評價該方法的特異性。

1.11 穩(wěn)定性評價分別選取高（1.0×108copies/μL）、中（1.0×106copies/μL）、低（1.0×104copies/μL）3種重組陽性質(zhì)粒不同濃度標準品，用SYBR Green實時熒光定量PCR進行檢測，分別進行10次重復試驗，計算其變異系數(shù)（coefficient of variation, CV），評價該方法的穩(wěn)定性。

1.12 統(tǒng)計學分析建立標準曲線：橫坐標為1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、1.0×101copies/μL 8個質(zhì)粒濃度，縱坐標為SYBR Green實時熒光定量PCR擴增所得Ct值，在Excel表中建立標準曲線，根據(jù)函數(shù)生成線性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)R2，理論上R2越接近1，則表示線性關(guān)系越好，可信度越高。變異系數(shù)：根據(jù)3種不同濃度重組陽性質(zhì)粒標準品，每種濃度做10次平行，依據(jù)10次重復SYBR Green實時熒光定量PCR所得的Ct值，計算其變異系數(shù)。變異系數(shù)值越小，說明平行樣本間的差值越小,即離散程度越?。蝗绻儺愊禂?shù)大于15%，在分析統(tǒng)計數(shù)據(jù)時則要考慮該數(shù)據(jù)可能不正常，應該剔除。變異系數(shù)的計算公式為:變異系數(shù)CV =(標準偏差SD/平均值Mean )× 100%。

2 結(jié) 果

2.1定量曲線如圖1所示，確診肺結(jié)核病人113例痰液標本DNA和標準結(jié)核分枝桿菌DNA在第一個循環(huán)結(jié)束后測到一個基礎吸光值，接下來到第8個循環(huán)時都沒有明顯變化。從第10個循環(huán)開始全部標本的吸光值逐漸增大，實時熒光定量曲線依次開始抬頭，15個循環(huán)（CT值）后，定量曲線走向迅速上揚，至27個循環(huán)后全部標本定量曲線達到峰值，隨后曲線進入平臺期，一直到PCR反應結(jié)束。陰性對照未出現(xiàn)擴增曲線。

圖1 SYBR Green實時熒光定量 PCR檢測肺結(jié)核病人113例痰液標本擴增曲線Fig.1 Amplification curve for SYBR Green real-time fluorescence quantitative PCR in detection of Sputum samples from 113 patients with puLmonary tubercuLosis

2.2 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果痰液標本DNA的驗證試驗，對所獲取的PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后進行重組陽性標準質(zhì)粒構(gòu)建，對其陽性質(zhì)粒測序，將所得測序結(jié)果經(jīng)NCBI中GENE BANK分析，結(jié)果顯示該產(chǎn)物為結(jié)核分枝桿菌核酸序列。

2.3 特異性實驗標本正常人的痰液58份，戈登分枝桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯球菌、肺炎鏈球菌痰液標本共計30份。提取DNA后為對照模板進行SYBR Green實時熒光定量PCR未檢測到熒光信號。

2.4 檢測限實驗對重構(gòu)的陽性質(zhì)粒進行10倍梯度稀釋，然后以稀釋液的不同拷貝數(shù)為模板進行SYBR Green實時熒光定量PCR檢測，熒光定量信號隨模板濃度下降而下降，線性范圍為l03-108copies/μL，檢測下線為l02copies/μL。如圖2～3所示，構(gòu)建的陽性質(zhì)粒標準品經(jīng)測序確定為M.tubercuLosis Smc，其質(zhì)粒濃度通過ND5000微量紫外分光光度計測定核酸為131.34 ng/μL，用過質(zhì)粒拷貝數(shù)的公式計算，得到質(zhì)?？截悢?shù)濃度為4.07×1010 copies/μL。對重組陽性質(zhì)粒10倍比稀釋，得到 l08、l07、106、l05、104、103、102、101copies/μL 8個梯度濃度標準品，通過SYBR Green實時熒光定量PCR，得到標準品質(zhì)粒的熒光定量擴增曲線，規(guī)定擴增Ct值＞35時，則擴增定義為陰性擴增，見圖2。圖中擴增曲線呈明顯的S型擴增，且指數(shù)增長期的擴增曲線趨于平行，說明此SYBR Green實時熒光定量PCR法擴增穩(wěn)定。所得起始拷貝數(shù)與Ct值呈一定的線性相關(guān)性，在Excel中制作標準曲線，通過函數(shù)呈現(xiàn)線性關(guān)系為：y =-1.379ln(×) + 41.056，相關(guān)系數(shù)R2=0.998，表明線性關(guān)系較好，可信度較高。

圖2 SYBR Green實時熒光定量 PCR檢測M.tubercuLosis質(zhì)粒標準品擴增曲線Fig.2 Amplification curve for SYBR Green real-time fluorescence quantitative PCR in detection of M.tubercuLosis standard plasmid

2.5 穩(wěn)定性評價選取高（1.0×107copies/μL）、中（1.0×105copies/μL）、低（1.0×103copies/μL）3種不同濃度重組陽性質(zhì)粒標準品，通過SYBR Green實時熒光定量PCR檢測，濃度由高到低的重組陽性質(zhì)粒分別進行10次重復試驗， 3組10倍倍比稀釋后的標準品Ct平均值分別是16.83、22.71、29.91，標準差分別是0.61、0.83、0.97，變異系數(shù)分別是1.1%、1.7%、2.4%，SYBR Green實時熒光定量PCR結(jié)果顯示隨著標準品拷貝數(shù)的降低，Ct值增大，標準差和變異系數(shù)也呈逐漸增大的趨勢。

圖3 SYBR Green實時熒光定量 PCR檢測M.tubercuLosis質(zhì)粒標準品標準曲線Fig.3 Standard curve for SYBR Green real-time fluorescence quantitative PCR in detection of M.tubercuLosis standard plasmid

2.6靈敏度實驗對確診肺結(jié)核病人113例痰液標本分別進行SYBR Green實時熒光定量PCR檢測和直接涂片染色法檢測。直接涂片染色法檢測的靈敏度為42.5%。SYBR Green熒光定量PCR靈敏度為99.1%。

3討論

肺結(jié)核的實驗室快速檢測對傳染肺結(jié)核的發(fā)現(xiàn)及治療具有重要的意義，目前，肺結(jié)檢測的相關(guān)方法主要有免疫學檢查、細菌學檢查和分子生物學檢查[7-9]。

檢測結(jié)核分枝桿菌是臨床結(jié)核病及時用藥的主要方法，傳統(tǒng)的檢測主要為直接圖片法和培養(yǎng)法，但直接涂片法存在特異性差、靈敏度低和不能鑒別抗酸菌死活的不足，而培養(yǎng)法則存在培養(yǎng)時間長和特異性差的缺點，實際臨床應用受到限制[10-11]。此方法中113例標本實時PCR陽性113例（99.1%），而直接涂片法只有49例（43.3%）

細菌學檢查是目前傳染性結(jié)核分枝桿菌診斷的金標準，檢測結(jié)果陽性對肺結(jié)核的診斷及治療具有重大意義，分枝桿菌的監(jiān)測方法主要是以痰涂片抗酸染色和細菌培養(yǎng)。但是，痰涂片抗酸染色后鏡檢法檢測結(jié)果的陽性率不高，一般為百分之18%～49%，且結(jié)果受標本質(zhì)量的影響相差很大。痰標本培養(yǎng)方法檢測結(jié)果的陽性率稍高于涂片法，能夠得到活菌，但結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)所需時間較長，傳統(tǒng)培養(yǎng)方法需要時間5～8周，實時PCR法與抗酸染色法相比較符合率為99.5%。隨著分子生物學的不斷發(fā)展，實時熒光定量PCR技術(shù)已經(jīng)廣泛用于菌種的檢測。熒光定量PCR方法與常規(guī)的分離培養(yǎng)法相比較，具有操作簡便，耗時短，特異性好等特點，參與反應的體系在密閉的PCR管中擴增，實時熒光檢測，一定程度上降低了標本污染，并可實時的反映定量監(jiān)測，為傳染病監(jiān)測提供參考依據(jù)。實時熒光定量PCR技術(shù)特別是對一些含菌量低的樣本（如尿液、胸腹水）檢測結(jié)果的判定具有非常實用的價值，提高了結(jié)核分枝桿菌的檢出率[12]。實時熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)果中會有少數(shù)假陽性的結(jié)果，但其方法與常規(guī)細菌學方法互補使用可提高陽性檢出率，不失為一種快速檢測結(jié)核病的輔助診斷方法。

本研究所建立的一種快速、靈敏、特異的檢測結(jié)核分枝桿菌的SYBR Green實時熒光定量PCR方法，基于結(jié)核分枝桿菌的Smc基因設計引物，并插入pMD18-T載體構(gòu)建標準陽性質(zhì)粒，送楊凌天潤奧科生物科技有限公司進行測序。并以測序正確的重組陽性質(zhì)粒作為質(zhì)粒標準品，質(zhì)粒標準品稀釋進行擴增的曲線平行性比較理想，標準曲線的線性關(guān)系較好。SYBR Green實時熒光定量PCR方法的靈敏度較高，該法對重組質(zhì)粒標準品的檢測靈敏度為1.0×102copies/μL；穩(wěn)定性好，對質(zhì)粒濃度為1.0×108copies/μL、1.0×106copies/μL、1.0×104copies/μL的標準品重復檢測10次，結(jié)果顯示擴增反應Ct值的CV為1.1 %～2.4 %。用SYBR Green實時熒光定量PCR方法檢測M.tubercuLosis總檢出率為99.1%，痰涂片抗酸染色鏡檢陽性率（42.5%）較低，是可能因為抗酸染色需受痰液中細菌數(shù)量限制，一般每毫升痰液至少含有（5×103）～（1×104）個細菌方可得出陽性結(jié)果，且由于結(jié)核病人是間歇性排菌，可能會造成假陰性[13]。這就要求我們在抗酸染色時要嚴格控制條件，以提高陽性率。而實時熒光定量PCR檢測法的陽性率明顯高于抗酸染色法和改良羅氏培養(yǎng)法，且特異性為99.1%，這和熒光定量PCR的原理和它所采用的一系列新技術(shù)密切相關(guān)，實時熒光定量PCR可以做到相對定量，且定量結(jié)果可以用于指導臨床用藥和療效評估。實時PCR是臨床上廣泛應用的一種基因定量檢測技術(shù)，使我們獲得一個從分子水平確定結(jié)核的新方法，為結(jié)核的快速檢測提供了有力參考[14]。本研究建立的SYBR Green實時熒光定量PCR法為結(jié)核分枝桿菌的檢測提供了基礎，對結(jié)核病的早發(fā)現(xiàn)、早治理有一定意義。