陳文鳳 張衛(wèi)星 王紅芳 胥保華

（山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018）

細胞對環(huán)境變化的反應部分是由一系列胞內(nèi)信號途徑來誘導的，信號通路接替、放大并整合來自胞外刺激的信號，最終導致基因和生理的改變。昆蟲為適應極端環(huán)境，體內(nèi)會啟動一系列代謝和調(diào)控反應。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號通路參與細胞的生長、發(fā)育、分化、凋亡等多種生理過程，不僅應答生物脅迫中的病原體感染，也對鹽、高溫、低溫、干旱等非生物脅迫有響應[1,2]。MAPK信號通路主要由ERK（extracellular signalregulated kinases）、JNK（The c-Jun amino-terminal kinases）和p38等并行的幾條信號通路組成。JNK主要參與細胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，p38主要參與細胞對炎癥因子和環(huán)境脅迫（UV、溫度、缺血缺氧）的響應，而ERK信號通路主要參與調(diào)控細胞分裂過程。ERK信號通路在MAPK信號通路中最早被發(fā)現(xiàn)且研究得最為深入。ERK包括ERK-1和ERK-2兩種激酶，該途徑主要介導有絲分裂信號向胞內(nèi)和核內(nèi)傳遞，調(diào)控細胞的生長過程[3]。

應激反應是受細胞內(nèi)信號系統(tǒng)調(diào)節(jié)的復雜過程，MAPK、G蛋白耦聯(lián)受體以及TGF-β等信號通路都參與應激反應[4,5]。當動物處于冷應激條件下時，動物機體作為一個整體發(fā)生反應，其神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)等均發(fā)生一系列多系統(tǒng)、多層次的協(xié)調(diào)效應，以提高機體的適應能力和維持內(nèi)環(huán)境的相對穩(wěn)定。動物應激及動物對應激原的適應具有分子基礎，可以認為是一種基因行為[6,7]。任何機體酶和蛋白質(zhì)的差異，其根本原因是基因表達的差異。在冷應激過程中主要表現(xiàn)為蛋白合成率的總體下降，但是某些蛋白的合成反而上升或嚴重下降，說明他們的表達受到了冷應激的特異性調(diào)節(jié)，并可能在冷應激過程中扮演重要角色[8]。ERK-A信號通路可將胞外刺激與胞內(nèi)功能聯(lián)系起來，通過研究ERK信號通路調(diào)節(jié)機制可以了解冷應激對細胞活動的影響。研究發(fā)現(xiàn)，ERK通路通過調(diào)節(jié)類固醇和山梨醇的合成來終止家蠶幼蟲的滯育過程，表明ERK通路參與了昆蟲在低溫條件下的代謝調(diào)節(jié)[9,10]。

雖然對蜜蜂抵抗低溫的生理生化機制已有很多研究[11]，但信號通路在中華蜜蜂低溫響應機制中的作用還鮮有報道，本研究通過將中華蜜蜂成蟲置于4℃環(huán)境下4 h，并在處理過程中取樣，取樣在3 min內(nèi)完成，取樣后立即將蜜蜂放回原處理條件下。利用實時定量PCR檢測ERK-A基因的表達量，探討ERK-A基因是否在中華蜜蜂適應低溫環(huán)境中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 供試蜂種

中華蜜蜂（簡稱中蜂，A.cerana cerana），飼養(yǎng)于山東農(nóng)業(yè)大學實驗研究基地。

1.2 主要試劑

BL21（DE）和感受態(tài)細胞DH5α購自北京全式金生物技術有限公司，克隆載體pEasy-T3購于TransGen公司，原核表達載體Pet-30a(+)由本實驗室提供。TaqDNA聚合酶、T4 DNA連接酶、dNTP、DNA Marker、SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit、各種限制性內(nèi)切酶購于寶生物工程(大連)有限公司（TaKaRa）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購于Solarbio公司；質(zhì)粒提取試劑盒Plasmid Mini Kit購于OMEGA公司；引物合成和測序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.3 PCR引物（表1）

表1 PCR引物

1.4 中華蜜蜂ERK-A基因的生物信息學分析

利用DNAMAN 6.0軟件將ERK-A基因的開放讀碼框翻譯成氨基酸序列，得到蛋白，在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上將ERK-A同其它物種進行Blast同源比對。在亞細胞定位預測網(wǎng)站(http://psort.hgc.jp/form.html)上預測該蛋白質(zhì)在細胞中的位置，利用MEGA 5軟件對不同物種ERK-A基因序列進行多重比對，通過NJ(neighbor joining)方法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 中華蜜蜂的低溫處理

選取正常蜂群中的中華蜜蜂320只，分成4組，每組80只，隨機選取三組在4℃冰箱中放置15 min、30 min、1 h、2 h、2.5 h、3 h、4 h，另一組放置于25℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，處理后直接將蜜蜂凍存在液氮中，將25℃飼養(yǎng)的蜜蜂成蟲作為對照，不作低溫處理直接凍存在液氮中，以單只蜜蜂為一個樣品，每個處理共3只蜜蜂（即3次重復)。

1.6 中華蜜蜂總RNA的提取、cDNA的合成以及實時熒光定量PCR

每群選取2只蜜蜂液氮研磨，Trizol法提取總mRNA，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa：DRR037A）立即反轉(zhuǎn)錄為cDNA，調(diào)節(jié)樣品cDNA濃度于相同水平后，-20℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR取1000 ng cDNA加入到20 μl熒光定量體系中，按照熒光定量試劑盒（TaKaRa）操作指南，用7500 Real-Time PCR儀（ABI 7500，USA）檢測目的基因相對表達量。反應程序：預變性95℃，10 s；變性95℃，5 s；退火60℃40 s，40個循環(huán)，熔解曲線添加，1個循環(huán)。目的基因引物設計參考序列來自于NCBI數(shù)據(jù)庫，以action為內(nèi)參，采用Primer 5.0進行引物設計，委托生工生物科技有限公司合成引物。

2 結(jié)果與分析

2.1 中華蜜蜂ERK-A基因cDNA的克?。▓D1）

圖1 ERK-A基因克隆

2.2 中華蜜蜂ERK-A基因cDNA的序列分析

通過DNAMAN 6.0軟件進行分析獲得中華蜜蜂ERK-A基因的開放讀碼框，含有1098 bp的堿基，編碼365個氨基酸，編碼蛋白質(zhì)命名為ERK-A，其分子量為42 kDa，等電點為6.03。ERK-A1/2 是細胞對外界信號產(chǎn)生應答的上游樞紐，通過亞細胞定位預測(http://psort.hgc.jp/form.html)，ERK-A主要存在于細胞質(zhì)中，且無信號肽編碼序列，無跨膜結(jié)構(gòu)(圖2)。ERK-A具有MAPK超家族的序列特征，即存在激酶的保守區(qū)和磷酸化位點(下劃線標的TEY序列)。

圖2 中華蜜蜂ERK-A的核酸與氨基酸序列

2.3 中華蜜蜂ERK-A蛋白的同源性分析

圖3 中華蜜蜂與其他物種的同源比對

將ERK-A的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站進行Blast比對，結(jié)果表明ERK-A與同為蜜蜂科Apis mellifera（GenBank登錄號：XP_393029.2）的相似性最高，一致性99.18%，與Harpegnathos saltator （GenBank登錄號：XP_017789097.1）的一致性97.81%。與Eufriesea Mexicana和Melipona quadrifasciata的一致性都在97%以上（圖3），說明該基因在進化上高度保守。

2.4 中華蜜蜂ERK-A基因的三維結(jié)構(gòu)預測及磷酸化位點分析

MAPK的激活都是通過TEY基序中蘇氨酸(T)和酪氨酸（Y）的同時磷酸化實現(xiàn)的。利用SWISSMODEL（http://www.swissmodel.expasy.org/）預測ERK-A激酶的三級結(jié)構(gòu)（圖4），可以看出，N端結(jié)構(gòu)域主要由β折疊組成，C端結(jié)構(gòu)域主要由α螺旋組成，兩個結(jié)構(gòu)域之間的裂痕(即無規(guī)則卷曲)為ATP結(jié)合的激活環(huán)，TEY基序就位于激活環(huán)內(nèi)[12]。

圖4 ERK-A的三維結(jié)構(gòu)剖面圖

2.5 中華蜜蜂ERK-A激酶與其他物種ERK-A激酶的系統(tǒng)樹構(gòu)建

從NCBI網(wǎng)站下載相近物種的部分ERK-A激酶序列，利用MEGA軟件，以酵母Saccharomyces merevisiae的ERK-A作為外群，通過Test Neighbor Joining Tree方法構(gòu)建以氨基酸序列為基礎的系統(tǒng)發(fā)生樹（圖5），結(jié)果表明：中華蜜蜂ERK-A和同為蜜蜂科的意大利蜜蜂Apis mellifera的ERK-A聚為一支，與蟻科的收獲蟻Pogonomyrmex barbatus和擬步甲科的赤擬谷盜Tribolium castaneum親緣關系較近。小鼠ERK-A和人ERK-A聚為一支，昆蟲ERK-A與哺乳動物ERK-A有更近的起源。

圖5 昆蟲ERK-A的系統(tǒng)進化樹

2.6 低溫脅迫下中華蜜蜂ERK-A基因的表達規(guī)律

為了研究ERK-A基因的表達是否對低溫脅迫做出響應，進行實時熒光定量PCR檢測。熒光實時定量PCR結(jié)果顯示，在低溫脅迫下ERK-A的表達均有顯著上調(diào)。在4℃脅迫30 min后，ERK-A的表達量就達到對照的2倍，2 h時達到最高峰是對照的4倍，此后雖有下降，但仍保持較高水平（圖6）。低溫表達分析說明，ERK-A基因的表達受到低溫的誘導，可能在中華蜜蜂應對低溫脅迫時發(fā)揮對細胞的調(diào)控作用。

圖6 低溫條件下ERK-A基因表達的變化

我們從蜜蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中獲得ERK-A基因的cDNA序列的完整開放閱讀框長1098 bp，編碼365個氨基酸，編碼蛋白ERK-A的分子量為42 kDa，等電點為6.03。同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因在進化上十分保守，在氨基酸水平上，與相近物種的ERK-A的一致性都達到97%以上，與意大利蜜蜂ERK-A的一致性達99.18%，表明ERK-A在生物體中都具有重要功能。本研究發(fā)現(xiàn)ERK-A在4℃呈上調(diào)表達，說明ERK-A通路可能參與了中華蜜蜂耐寒機制的調(diào)控。

3 結(jié)論與討論

真核細胞已經(jīng)形成了特殊的信號轉(zhuǎn)導通路來響應細胞外的各種刺激，絲裂原蛋白激酶MAPK組成了一個絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，通過磷酸化作用激活受體，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化和脅迫響應[13]。在比較生物化學領域，MAPK信號通路在代謝調(diào)節(jié)和生化適應方面的研究還比較少見，最初關于MAPK信號通路在缺氧狀態(tài)、熱應激和冷應激等方面的代謝應答的研究也僅僅觸及其表面[14]。

通常認為，ERK通路主要參與細胞存活和生長繁殖，其有效激活信號分子包括生長因子、激素、神經(jīng)遞質(zhì)、鈣離子等[15]，而p38和JNK主要參與生長抑制和細胞凋亡，其有效激活因素有溫度、缺血缺氧等各種環(huán)境刺激[16]。ERK主要被生長因子、多肽類激素以及神經(jīng)遞質(zhì)激活，控制細胞增殖、分化、生存和凋亡。本研究中，ERK-A基因的表達受低溫誘導，可能與ERK、p38和JNK三條通路的相互作用有關[17,18]。

本研究從中華蜜蜂轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得ERK-A基因的cDNA，該基因在低溫條件下上調(diào)表達，說明在中華蜜蜂中ERK通路可能參與了低溫下的信號轉(zhuǎn)導。昆蟲的一生會經(jīng)常性受到來自環(huán)境的各種各樣的刺激，昆蟲的誘導表達適應機制提示人們，昆蟲對環(huán)境的適應是一個能動的過程。昆蟲通過啟動與抗低溫有關的基因并使之表達，給出逆境保護措施，從而協(xié)助昆蟲度過難關或逆境。因此，研究與冷應激密切相關的基因，探討如何迅速誘導昆蟲冷適應機制的高效運作，提高昆蟲在不利環(huán)境下的存活率，將是現(xiàn)在乃至將來昆蟲學家應傾力研究的課題。此外，不同類型的應激可以誘導不同的應激蛋白，后者即可用來判斷昆蟲受到何種應激和應激的程度。研究冷應激過程中發(fā)生改變的這些蛋白用以衡量應激的程度，作為指導我們工作和生產(chǎn)的一個標準。因此，從分子水平上研究冷應激的分子機制，將具有極大的基礎研究和實踐應用價值，研究MAPK信號通路對低溫脅迫的調(diào)控，有助于全面了解昆蟲的耐寒機制。

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