盛須仁，邢松歌，葛勇勝，莢衛(wèi)東

[中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院） 肝臟外科/肝膽胰外科安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230001]

肝細(xì)胞癌（HCC）是原發(fā)性肝癌的主要類型，約占70%～90%，在癌癥相關(guān)致死原因中，肝癌位居前列。值得注意的是，全球大約有50%的HCC新發(fā)病例和死亡病例發(fā)生在中國(guó)[1]，HCC已成為威脅我國(guó)人民健康的重大疾病。國(guó)外有文獻(xiàn)[2]報(bào)道，HCC的5年生存率僅為11%。造成HCC預(yù)后差的最主要原因之一是缺乏有效的早期診斷手段，大多數(shù)患者一經(jīng)發(fā)現(xiàn)就被診斷為無法行根治性手術(shù)的晚期階段。因此，發(fā)現(xiàn)具有診斷價(jià)值的生物學(xué)指標(biāo)對(duì)于HCC的早期診斷和預(yù)后是有必要的。近幾年有研究[3-5]表明：TUSC3（tumor suppressor candidate 3，腫瘤抑制候選基因3）與卵巢癌、前列腺癌、小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。TUSC3與HCC的關(guān)系目前研究較少，本研究檢測(cè)TUSC3在HCC中的表達(dá)情況，并初步探討TUSC3的表達(dá)與HCC患者相關(guān)臨床病理特征之間的關(guān)系及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 病例資料

收集2007年1月—2012年12月于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院肝臟外科行根治性HCC切除術(shù)的92例HCC組織石蠟切片，其中年齡20～74歲，平均年齡51歲；有血管侵犯者（鏡下癌栓或肉眼癌栓）58例，無血管侵犯者34例；腫瘤分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)采用Edmondson分級(jí)法[6]，I～I(xiàn)I級(jí)者55例，III～I(xiàn)V級(jí)者37例；腫瘤TNM分期標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)（AJCC）第八版標(biāo)準(zhǔn)[7]，I～I(xiàn)I期者62例，III～I(xiàn)V期者30例（表1）。另外收集2016—2017年于安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院肝臟外科行HCC切除術(shù)的新鮮冷凍HCC組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織20對(duì)和TRIzol浸泡的HCC組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織20對(duì)，行Western blot及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。其中男17例，女3例；年齡39～61歲，平均年齡53歲；有血管侵犯者（鏡下或肉眼癌栓）9例，無血管侵犯者11例。所選患者術(shù)前均未行放療、化療、介入等抗腫瘤治療。該研究資料獲得患者及家屬的書面同意及安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院臨床試驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理批件號(hào)2017倫審第114號(hào)）。

1.2 主要試劑

兔抗人多克隆抗體TUSC3（LSBio公司）；通用山羊抗鼠/兔二抗PV-6000（北京中杉金橋公司）；DAB顯色試劑盒（北京中杉金橋公司）；蘇木素染色劑（北京中杉金橋公司）； RIPA蛋白裂解液（北京碧云天公司）；MARK（美國(guó)Fermentas公司）；TRIzol試劑、ECL 超敏發(fā)光試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Thermo公司），雙色定時(shí)定量PCR儀（美國(guó)BIO-RAD MYIQ2）；qRTPCR引物（英濰捷基上海貿(mào)易有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化 本研究選用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法（SP法）對(duì)HCC及癌旁組織中TUSC3的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，65 ℃烘烤石蠟切片，二甲苯及梯度乙醇脫蠟水化，檸檬酸高溫修復(fù)抗原，過氧化氫室溫孵育10 min，封閉過氧化物酶，加入兔抗人TUSC3多克隆抗體（1:200），4 ℃孵育過夜，37 ℃復(fù)溫，PBS沖洗3遍，吐溫1遍，二抗37 ℃孵育30 min，PBS沖洗3遍，吐溫1遍，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，自來水沖洗后藍(lán)化，乙醇脫水，最后中性樹膠封片。免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：每張切片在400倍顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)視野，根據(jù)著色細(xì)胞所占百分比評(píng)分：＜10%細(xì)胞著色為0分；10%～30%細(xì)胞著色為1分；30%～50%細(xì)胞著色為2分；＞50%細(xì)胞著色為3分。另外根據(jù)著色細(xì)胞強(qiáng)度評(píng)分：未顯色或顯色不清為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。切片最終分?jǐn)?shù)=著色細(xì)胞所占百分比分?jǐn)?shù)×著色細(xì)胞強(qiáng)度評(píng)分，分?jǐn)?shù)≥5分定為高表達(dá)，得分＜5分定位低表達(dá)。

1.3.2 Western blot法檢測(cè) 取HCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織，加入RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法蛋白定量測(cè)定，每對(duì)樣本等量蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后轉(zhuǎn)蛋白至PVDF膜上，Western 洗滌液漂洗蛋白膜5 min，脫脂奶粉室溫?fù)u床中封閉1 h，TUSC3一抗（1:500）4 ℃搖床中孵育過夜，TBST洗膜3次，二抗（1:1 0000）室溫孵育2 h，TBST洗后用化學(xué)發(fā)光試劑盒顯影,凝膠成像系統(tǒng)掃描，保存、導(dǎo)出圖像，最后采用Quantity one圖像分析軟件進(jìn)行灰度值分析。用鼠抗人β-actin作內(nèi)參對(duì)照，方法同上。TUSC3條帶灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值之比用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3.3 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè) 提取HCC與癌旁組織總RNA，合成cDNA，采取三步法進(jìn)行qRTPCR反應(yīng)：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)，每樣本每基因設(shè)置3個(gè)重復(fù)。引物正向序列：5'-GAG TTC CAG ACG CTC AAT CTT C-3'，反向序列：5'-GCC AGG AGT TCG CCA GTA TT-3'擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：173 bp；內(nèi)參18s引物正向序列：5'-CGG CGA CGA CCC ATT CGA AC-3'，反向序列：5'-GAA TCG AAC CCT GAT TCC CCG TC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為：180 bp；TUSC3mRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0及Graph Prism 5.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，本研究中所涉及定量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，定性資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TUSC3在HCC組織中的表達(dá)下調(diào)

免疫組化結(jié)果顯示，在92例組織切片中，有56例（60.9%）顯示TUSC3在HCC組織細(xì)胞質(zhì)中呈低表達(dá)，36例呈高表達(dá)；癌旁肝組織細(xì)胞質(zhì)中呈低表達(dá)者33例（35.9%），呈高表達(dá)者59例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）（圖1）。

圖1 免疫組化檢測(cè)TUSC的表達(dá) A，E：HCC組織中TUSC3的低表達(dá)；B，F(xiàn)：HCC組織中TUSC3的高表達(dá)；C，G：癌旁組織中TUSC3的低表達(dá)；D，H：癌旁組織中TUSC3的高表達(dá)Figure 1 Immunohistochemical staining for TUSC expression A, E: Low TUSC3 expression in HCC tissue; B, F: High TUSC3 expression in HCC tissue; C, G: Low TUSC3 expression in adjacent tissue; D, H: High TUSC3 expression in adjacent tissue

2.2 TUSC3在HCC組織中的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

TUSC3在HCC組織中的低表達(dá)與腫瘤Edmondson分級(jí)、TNM分期、腫瘤直徑有關(guān)（P=0.008，P=0.031，P=0.020）；與年齡、性別、腫瘤包膜、血管侵犯、AFP、HBsAg、肝硬化、Child-Pugh分級(jí)、腫瘤數(shù)無關(guān)（均P＞0.05）（表1）。

表1 TUSC3的表達(dá)與患者臨床病理特征之間的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of TUSC3 expression with clinicopathologic features of the patients [n (%)]

2.3 qRT-PCR與Western blot檢測(cè)結(jié)果

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，20對(duì)標(biāo)本中17對(duì)（85%）TUSC3在癌組織中的mRNA表達(dá)低于對(duì)應(yīng)癌旁組織。定量結(jié)果顯示，20對(duì)標(biāo)本中TUSC3在HCC組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（0.99±1.46）和（1.96±2.18），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.237，P＜0.01）（圖2）。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，20對(duì)標(biāo)本中16對(duì)（80%）TUSC3在癌組織中的蛋白表達(dá)低于對(duì)應(yīng)癌旁組織。定量結(jié)果顯示，20對(duì)標(biāo)本中TUSC3在HCC組織及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為（0.49±0.35）和（1.04±0.43），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.909，P＜0.001）（圖3）。

圖2 TUSC3 mRNA在20對(duì)HCC及癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量Figure 2 Relative TUSC3 mRNA expressions in the 20 paired HCC and adjacent tissues

圖3 Western blot檢測(cè)TUSC的表達(dá) A：TUSC3蛋白在4對(duì)代表性HCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)；B：TUSC3蛋白在20對(duì)HCC及對(duì)應(yīng)癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量Figure 3 Western blot analysis for TUSC expressionA: TUSC3 expressions in 4 representative paired HCC and adjacent tissues; B: Relative TUSC3 protein expressions in the 20 paired HCC and adjacent tissues

3 討 論

TUSC3基因位于人類第8號(hào)染色體短臂8p22，又名N33[8]，早期研究[9-11]表明TUSC3與常染色體隱性精神發(fā)育遲滯密切相關(guān)。目前研究[4,12-13]表明TUSC3在腫瘤中也扮演著重要的角色，TUSC3編碼的蛋白質(zhì)是寡糖基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物中的亞基，參與蛋白質(zhì)折疊過程中的N端糖基化反應(yīng)。TUSC3的表達(dá)異?？筛淖僋端糖基化的進(jìn)程，而異常的N端糖基化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切關(guān)系[14-16]。TUSC3的表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展間的確切機(jī)制仍未明確，TUSC3與惡性腫瘤之間的研究正在陸續(xù)開展。

Pils等[17]通過對(duì)卵巢癌細(xì)胞系及腫瘤標(biāo)本的研究顯示由于TUSC3啟動(dòng)子區(qū)的過甲基化，TUSC3在卵巢癌中的表達(dá)明顯下調(diào)，TUSC3的缺失可促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，并提出可能與異常的N端糖基化反應(yīng)有關(guān)。TUSC3啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)與卵巢癌的無進(jìn)展生存期及總體生存期有明顯相關(guān)，TUSC3為卵巢癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[3,17]。Kratochvílová等[18]的進(jìn)一步研究提出TUSC3通過調(diào)節(jié)卵巢癌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)以及阻止其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)揮腫瘤抑制作用。Horak等[4]報(bào)道了在前列腺癌患者中TUSC3的表達(dá)下調(diào)與啟動(dòng)子區(qū)甲基化明顯相關(guān)，并且在進(jìn)展期腫瘤中下調(diào)明顯，并提出在前列腺上皮細(xì)胞中TUSC3的缺失可能促進(jìn)腫瘤的生成和進(jìn)展，TUSC3在前列腺癌中扮演著抑癌基因的角色。有研究[5]顯示TUSC3在小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)下調(diào)，TUSC3的缺失與低分化肺癌相關(guān)，同時(shí)通過分析TUSC3的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性提出TUCS3可能成為肺癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)指標(biāo)。值得注意的是，研究[19]顯示TUSC3在非小細(xì)胞肺癌中呈高表達(dá)，TUSC3高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞表現(xiàn)出較高的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移能力，TUSC3在非小細(xì)胞肺癌中表現(xiàn)出致癌作用，其作用機(jī)制可能與Hedgehog信號(hào)通路有關(guān)。研究[20-21]顯示在多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤（GBM）中TUSC3的表達(dá)下調(diào)，TUSC3啟動(dòng)子區(qū)過度甲基化是其表達(dá)下調(diào)的原因，TUSC3通過抑制Akt信號(hào)通路的活性來調(diào)控GBM細(xì)胞的增殖和侵襲。研究[22-23]表明TUSC3在胰腺癌中的缺失，TUSC3的表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞系的增殖、遷移和侵襲，且TUSC3的表達(dá)下調(diào)與胰腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)。另有研究[24]表明在結(jié)直腸癌腫瘤標(biāo)本中TUSC3的表達(dá)上調(diào)，過表達(dá)的TUSC3誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，TUSC3過表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力增加，TUSC3在結(jié)直腸癌中表現(xiàn)出致癌作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)MAPK、PI3K/Akt、和Wnt/β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)。然而，又有一項(xiàng)對(duì)156例早期結(jié)直腸癌患者的研究[25]表明，TUSC3蛋白表達(dá)缺失與患者較差的總體生存率有關(guān)?；谇叭说难芯?，TUSC3在不同惡性腫瘤中的作用及可能機(jī)制不盡相同。目前關(guān)于TUSC3與HCC之間的研究較少，TUSC3在HCC中的表達(dá)情況及其與HCC患者臨床病理特征之間的關(guān)系未見報(bào)道。本項(xiàng)研究目的在于檢測(cè)TUSC3在HCC中的表達(dá)情況，并分析TUSC3的表達(dá)與HCC患者相關(guān)臨床病理特征之間的關(guān)系。本研究免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)、Western blot及qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均顯示TUSC3在HCC中的表達(dá)下調(diào)。推測(cè)TUSC3在HCC中的表達(dá)下調(diào)很可能與TUSC3基因啟動(dòng)子區(qū)過甲基化有關(guān)，具體機(jī)制有待于更大樣本更深入的研究。另外，臨床資料分析顯示TUSC3表達(dá)下調(diào)與腫瘤Edmondson分級(jí)、TNM分期、腫瘤直徑有關(guān)（P=0.008，P=0.031，P=0.020）；而與年齡、性別、腫瘤包膜、血管侵犯、AFP、HBsAg、肝硬化、Child-Pugh分級(jí)、腫瘤數(shù)目無關(guān)（P＞0.05）。這提示TUSC3表達(dá)的下調(diào)可能進(jìn)一步增加HCC的增殖能力、侵襲性及惡性程度，與患者腫瘤的惡性進(jìn)展程度息息相關(guān)。本研究揭示了TUSC3在HCC中的表達(dá)情況以及TUSC3表達(dá)與臨床病理資料之間的相關(guān)性，TUSC3可能會(huì)在HCC的早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)中發(fā)揮作用。本研究未探究TUSC3在HCC細(xì)胞系中表達(dá)情況，未能具體闡述TUSC3在HCC發(fā)生發(fā)展中作用的具體機(jī)制，大樣本更深入地研究TUSC3在HCC中的作用靶點(diǎn)及調(diào)控機(jī)制是很有必要的，TUSC3有可能成為HCC分子靶向治療新的位點(diǎn)。

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