詹瑋，田甜，余蕾，劉靜，廖欣，蔡立君，甄運寰

（貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院 1. 普通外科 3. 放射科 4. 神經(jīng)內(nèi)科，貴州 貴陽 550004；2. 貴州醫(yī)科大學 病理生理學教研室，貴州 貴陽 550025）

肝癌在世界上常見惡性腫瘤中排列第5位，且全球發(fā)病率不斷上升，而我國每年肝癌的發(fā)病例數(shù)占全世界的55%，并且這一數(shù)字還在逐漸增加[1]。研究[2]表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移是多個癌基因、抑癌基因及腫瘤生長因子共同造成。不論是否接受藥物或手術(shù)治療的肝癌患者，其病死率排列第3位，新近報道[3]全世界每年有大約75萬肝癌患者，而其5年生存率僅為0～14%。研究[4]表明，藍莓是目前水果及蔬菜中花青素含量最高的?；ㄇ嗨厥且活愄烊簧?，對人類的健康具有重要意義[5]。本研究自貴州省麻江縣藍莓種植基地采摘的藍莓提取花青素，并用高效液相色譜法法進行鑒定，用xCELLigence RTCA、免疫熒光、Western blot分析藍莓花青素對HepG2細胞增殖、凋亡的影響，并從表觀遺傳學中組蛋白乙?；剿髌湓谡T導細胞凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HepG2細胞為本實驗室保存；藍莓購自貴州省麻江縣藍莓種植基地，品系為杜鵑花科越橘屬矮叢藍莓，品種為巴爾德溫，-80 ℃液氮凍存。

1.2 主要試劑

胎牛血清購自G i b c o公司；D M E M培養(yǎng)基購自HyClone公司；DNase I、彩虹Marker購自Solarbio；細胞裂解液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白定量試劑盒、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒、Alexa Fluor488標記山羊抗小鼠IgG（H+L）、DyLight549標記山羊抗兔IgG（H+L）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；H3、H3K9、H3K14、H3K18、H3K27抗體均購自abcam公司。實時無標記細胞分析儀有杭州艾森生物有限公司提供，用于檢測（real time cellular analysis，RTCA）。

1.3 實驗方法

1.3.1 藍莓花青素的提取及鑒定 藍莓自–80 ℃中取出，稱重碾磨，用含0.1%鹽酸（HCl）的甲醇作為提取溶劑，按藍莓與提取溶劑1:4的比例，將碾磨后的藍莓溶于其中2 h。將混合物4 000r/min離心15 min，0.25 μm濾器進行過濾，通過40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除殘留的鹽酸及甲醇。利用大孔樹脂AB-8對粗提物進行純化，純化后的花青素利用高效液相色譜法（HPLC-MS）鑒定，通過與質(zhì)譜庫中的數(shù)據(jù)進行比較，分析藍莓花青素的成分。

1.3.2 細胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清及青、鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基置于5%、37 ℃細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，定期換液傳代，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3.3 細胞增殖抑制率的檢測 取對數(shù)生長期的HepG2細胞，在E-Plate內(nèi)加入50 μL DMEM，檢測基線，確保每個實驗孔的Cell Index低于0.063，取出板后，加入調(diào)整好不同濃度梯度藍莓花青素[6]（50、100、150、200、300 μg/mL）100 μL 混勻的HepG2細胞懸液加入所需檢測板內(nèi)，使每孔細胞數(shù)目在5 000細胞/100 μL，同時設(shè)置未用花青素處理細胞的對照組。將E-Plate靜置在超凈臺內(nèi)30 min后，放入RTCA Station上檢測，使用iCELLigenic系統(tǒng)每隔15 min檢測細胞的貼壁、生長和增殖過程，監(jiān)測48 h。傳感器檢測獲得的細胞阻抗參數(shù)用細胞指數(shù)（cell index）表示，實驗重復3次。檢測藍莓花青素對HepG2細胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）。根據(jù)抑制率（%）=（正常組-實驗組）/正常組×100%。

1.3.4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡取對數(shù)生長期的HepG2于3 cm無包被的塑料皿中鋪1×105個細胞，置于CO2孵箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁80%左右，棄舊培養(yǎng)液，PBS洗3次，加入含胎牛血清10%的全培養(yǎng)液調(diào)整好的不同濃度藍莓花青素培養(yǎng)液（50、100、150、200、300 μg/mL）培養(yǎng)作用于細胞；培養(yǎng)結(jié)束后，普通光鏡下觀察花青素處理后的HepG2細胞形態(tài)。按順序加入Annexin V-FITC 結(jié)合液 15 μL/皿，Annexin V-FITC 5 μL/皿，PI 10 μL/皿，室溫搖床避光孵育20 min，分別在倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.3.5 Western blot法 檢 測HepG2細 胞 中acH3K9、acH3K14、acH3K18修飾水 平 收集各組細胞，加入蛋白裂解液，冰上裂解10 min，12 000r/min、4 ℃、20 min，棄沉淀，收集上清，使用BCA蛋白定量試劑盒進行蛋白定量，具體操作步驟依照說明書進行。蛋白定量后，取40 μg總蛋白上樣，聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉，分別加入1:5 000稀釋的兔抗acH3K9抗體、1:1 000稀釋的兔抗acH3K14抗體、1:1 000稀釋的兔抗acH3K18抗體，1:1 000稀釋的兔抗acH3K18抗體，4℃搖床過夜。第2天，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1:4 000）室溫孵育90 min，TBST洗膜3次，ECL發(fā)光成像，以H3為內(nèi)參照。條帶用Image lab.lnk圖像分析軟件對每個條帶灰度值進行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用最小顯著性差異法（LSD法）。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同藍莓花青素處理HepG2細胞后的細胞形態(tài)

不同濃度藍莓花青素處理HepG2細胞后，與對照組比較，細胞形態(tài)發(fā)生顯著改變；50 μg/mL藍莓花青素處理HepG2細胞48 h后，隨著藍莓花青素濃度的不斷增加，細胞的體積進一步縮小，漂浮的細胞逐漸增多（圖1）。

圖1 不同藍莓花青素組處理后的HepG2細胞形態(tài)變化（×200） A：對照組；B：花青素50 μg/mL；C：花青素100 μg/mL；D：花青素 150 μg/mL；E：花青素 200 μg/mL； F：花青素 300 μg/mLFigure 1 Morphological changes in HepG2 after treated with different concentrations of blueberry anthocyanin (×200) A: Control group;B: Anthocyanin 50 μg/mL; C: Anthocyanin 100 μg/mL; D: Anthocyanin 150 μg/mL; E: Anthocyanin 200 μg/mL; F: Anthocyanin 300 μg/mL

2.2 藍莓花青素對HepG2細胞增殖的影響

RTCA結(jié)果顯示，100、150、200、300 μg/mL的花青素對HepG2細胞均有抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），且呈濃度依賴性。除50 μg/mL外，其余濃度組在近48 h后均顯示出大于50%的抑制率（圖2）。

圖2 不同濃度藍莓花青素處理后HepG2增殖的時-效曲線Figure 2 The time-effect curves of HepG2 cells after treatment with different concentrations of blueberry anthocyanin

2.3 熒光顯微鏡觀察花青素對HepG2細胞凋亡的影響

在熒光顯微鏡下，Annexin V-FITC/PI染色后，觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細胞基本沒有熒光信號，藍莓花青素處理后的HepG2細胞，可見隨著濃度的增加，細胞出現(xiàn)凋亡逐漸增多，凋亡細胞早期細胞膜被綠染，隨花青素不同濃度處理后的HepG2細胞，凋亡明顯增多，細胞核被紅染（圖3）。

2.4 Western blot法檢測藍莓花青素對HepG2細胞組蛋白乙?；挠绊?/h3>

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比較，各組藍莓花青素處理HepG2細胞中acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾增加（均P＜0.01）（圖4）。

圖3 不同濃度藍莓花青素處理HepG2細胞的凋亡情況（×200） A：對照組；B：花青素50 μg/mL；C：花青素100 μg/mL；D：花青素 150 μg/mL；E：花青素 200 μg/mL； F：花青素 300 μg/mLFigure 3 The apoptosis of HepG2 cells after treatment with different concentrations of blueberry anthocyanin (×200) A: Control group; B: Anthocyanin 50 μg/mL; C: Anthocyanin 100 μg/mL; D: Anthocyanin 150 μg/mL; E: Anthocyanin 200 μg/mL;F: Anthocyanin 300 μg/mL

圖4 Western blot檢測HepG2細胞acH3K9、acH3K14、acH3K18、acH3K27修飾情況Figure 4 Western blot analysis for acetylation of acH3K9, acH3K14, acH3K18, and H3K27 in HepG2 cells

3 討 論

近年來，將食物中的天然營養(yǎng)成分作為綜合防治腫瘤引起了廣泛的關(guān)注。本研究使用貴州省麻江縣藍莓提取的花青素，有待于闡明其對肝癌細胞在表觀遺傳學中的組蛋白乙酰化修飾的相應(yīng)位點抑制肝癌細胞發(fā)展進程的潛在關(guān)系。

原發(fā)性肝癌的主要病因是H B V、H C V及HDV[7]感染、黃曲霉素的接觸，過量飲酒，非酒精性脂肪肝及肝硬化[8]。原發(fā)性肝癌按組織學分類可分為肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC），膽管細胞癌（cholangiocarcinoma，CC）和混合型肝癌（mixed carcinoma of liver，MCL），其中以HCC為主要類型[9]，具有侵襲性強、進展快、易轉(zhuǎn)移，早期診斷相對困難等特點，但其發(fā)病機制尚不明了，過去認為環(huán)境因素改變后導致遺傳學的改變是腫瘤發(fā)生的原因，目前，越來越多的實驗證明其發(fā)生是一個多步驟、多基因、多階段與遺傳及表觀遺傳共同參與的復雜過程[10]。有研究[11]表明在體外藍莓花青素對HBeAg具有一定的抑制作用。

表觀遺傳是指不通過改變DNA序列就能影響基因表達的、可遺傳的遺傳修飾，組蛋白修飾包括甲基化、乙?；?、磷酸化、泛素化等[12-13]。然而這些修飾的程度與狀態(tài)決定著基因是否表達[12]。組蛋白乙酰化修飾是通過組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（histon acetyltransferases，HATs）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）聯(lián)合調(diào)控，取決于HAT和HDAC的動態(tài)平衡[14]。有研究[15-17]表明高乙?；芍泻徒M蛋白賴氨酸殘基的正電荷，減少組蛋白與DNA的接觸，利于轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合進行轉(zhuǎn)錄，而低乙?；鹣喾吹男?yīng)。組蛋白乙?；揎椂嘣贖3賴氨酸殘基上的9、14、18、23位點和H4精氨酸殘基上的5、8、12、16位點，而這些位點可激活基因也可沉默基因[18-19]。組蛋白有多種修飾方式，其中H3K9乙酰化是修飾基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的重要機制[20]。

藍莓因富含花青素具有延緩衰老、調(diào)節(jié)免疫功能及抗癌等多種功效[21]。國內(nèi)外均有文獻[22-23]報道藍莓可抑制體外HSCs的活化。因此，本研究藍莓中花青素對肝癌HepG2細胞的細胞凋亡及組蛋白乙?；揎椖承┪稽c的影響，而目前藍莓花青素誘導肝癌細胞凋亡的機制尚不明確，是否通過組蛋白乙?；嚓P(guān)位點進行調(diào)控，亟待進一步的研究。

本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，藍莓花青素對肝癌HepG2細胞的細胞學形態(tài)及細胞凋亡有著濃度依賴性，隨著藍莓花青素濃度的增加，凋亡逐漸增多，這與Yi等[24-25]發(fā)現(xiàn)藍莓內(nèi)所含的花青素能抑制Caco-2及HT-29大腸癌細胞株的增生并使其凋亡的研究一致。使用RTCA檢測細胞增殖結(jié)果顯示，100、150、200、300 μg/mL的花青素對HepG2細胞均有抑制作用，差異具有統(tǒng)計學意義，且呈劑量依賴性，其中以加入濃度為100 μg/mL培養(yǎng)48 h后已顯示出＞50%的抑制率。通過Western blot檢測，對照組與100 μg/mL組的HepG2細胞相比，組蛋白乙?；揎椀南鄳?yīng)位點，H3K9、H3K14、H3K18、H3K27的修飾水平是增高了，綜合以上實驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)藍莓中的花青素可以使得肝癌細胞形態(tài)學發(fā)生改變，促進其死亡，通過凋亡也發(fā)現(xiàn)了藍莓花青素可使肝癌細胞的凋亡增加，使用免疫印跡分析法也發(fā)現(xiàn)了在肝癌細胞中的組蛋白乙?；揎椝降玫搅讼鄳?yīng)的提升。

由于細胞的凋亡是一個復雜的過程，本實驗初步探討了貴州省麻江縣藍莓中花青素對HepG2胞凋亡的作用及少部分組蛋白乙?；揎椢稽c的變化情況，具體是否通過該途徑引起細胞凋亡，目前尚不清楚，需進一步的深入研究。

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