韓樹坤，李忠民，韓冰，胡旭明，孫度

（1. 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院 普通外科，遼寧 沈陽 110032；中國醫(yī)科大學(xué)遼陽市中心醫(yī)院 2. 普通外科 3. 呼吸科，遼寧 遼陽 111000）

中國是全球肝癌發(fā)病率最高的國家，疾病病死率在癌癥中位居第3位[1]。手術(shù)仍然是現(xiàn)階段患者長期生存的主要治療手段，但是術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移高，此外，約80%的患者初診時就已處于晚期或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移而失去手術(shù)機會[2-3]。因此，探討肝癌轉(zhuǎn)移的機制，尋找行之有效的干預(yù)手段成為改善肝癌治療現(xiàn)狀的關(guān)鍵。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是長度＞200個核苷酸的非編碼RNA，可調(diào)控轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后和翻譯后等水平的基因表達模式，在多種生理學(xué)（包括細胞增殖、表觀調(diào)控、基因組印記和X染色體失活等）和病理學(xué)（包括癌癥、神經(jīng)退行性疾病、免疫功能障礙、心血管及代謝性疾病等）過程中發(fā)揮重要作用[4]。肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）屬于lncRNA家族成員，最早是在進行非小細胞肺癌研究中發(fā)現(xiàn)[5]。越來越多的證據(jù)顯示MALAT1在多種腫瘤中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。有證據(jù)顯示MALAT1在多種腫瘤中均呈高表達，并且有望成為腫瘤診斷指標[6-7]。那么，在肝癌中 MALTA1的表達情況以及其在肝癌中發(fā)揮的作用值得我們深入研究。

本研究擬通過q R T-P C R檢測肝癌組織中MALAT1的表達情況，并分析其與臨床資料各參數(shù)之間的關(guān)系，同時通過細胞實驗檢測MALAT1在肝癌細胞中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標本來源 85例肝癌組織及其配對癌旁組織（距腫瘤邊緣＞5 cm）由2009年1月—2011年12月于中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院和中國醫(yī)科大學(xué)遼陽中心醫(yī)院確診為肝細胞癌經(jīng)手術(shù)治療并經(jīng)患者簽署知情同意書后取得。所有患者術(shù)前均未接受化療及放療?；颊叩闹形荒挲g62歲，臨床病理參數(shù)包括：性別、年齡、腫瘤大小、部位、病理類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及門靜脈浸潤情況。新鮮標本切除后立即應(yīng)用液氮快速冷凍儲存。

1.1.2 主要材料及試劑 肝癌細胞株SMMC-7721購自于中國科學(xué)院上海細胞生物研究所細胞庫。DMEM培養(yǎng)基，血清購自于逍鵬生物公司（Biological Industries，Israel），Transwell小室購自美國Corning公司；MALAT1質(zhì)粒購自吉凱公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?2000購自Invitrogen公司；引物序列由北京鼎國生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) SMMC-7721細胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，胰酶消化傳代。取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染 取處于對數(shù)生長期細胞（細胞生長密度約為50%時）用于轉(zhuǎn)染，經(jīng)LipofectamineTM2000介導(dǎo)，按照試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后孵箱內(nèi)繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h，收集細胞用于實驗檢測。

1.2.3 qRT-PCR qRT-PCR檢測mRNA的表達。按說明書提取各組細胞中的總RNA。cDNA的合成以18 s作為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)為20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為 16 ℃ 30 min，42 ℃ 30 min，85 ℃5 min，4 ℃保存。以18s作為內(nèi)參，qRT-PCR反應(yīng)采用20 μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。所有反應(yīng)均設(shè)3個復(fù)孔。采用相對定量法，測定目的基因、18s的PCR產(chǎn)物的Ct值，代入公式2-△△Ct，實驗重復(fù)3次。

1.2.4 Transwell小室遷移實驗 取對數(shù)生長期的細胞，對照組、MALAT組、siMALAT組含無血清的培養(yǎng)基重懸，每個Transwell小室的上室加入5×104細胞，下室加入500 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)液，加入時避免氣泡的產(chǎn)生。置于孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄上室中培養(yǎng)液，PBS洗3次，4%多聚甲醛固定20 min。用棉簽吸去上室內(nèi)液體，1%結(jié)晶紫染液室溫下染色10 min，PBS洗3次，顯微鏡下每孔隨機取5個視野拍照。每組細胞均設(shè)3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell小室侵襲實驗 將預(yù)冷的Matrigel膠與無血清培養(yǎng)基按1:8比例稀釋，將膠鋪于Transwell小室上下室之間，每孔80 μL均勻包被于Transwell小室底部膜內(nèi)，置培養(yǎng)箱60 min使之成膠。其余步驟同遷移實驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，分別采用秩和檢驗、Spearson相關(guān)分析、進行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，進行方差分析及t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MALAT1在肝癌組織中的表達

應(yīng)用qRT-PCR檢測肝癌以及對應(yīng)癌旁組織組織標本中MALAT1的表達，結(jié)果表明MALAT1在肝癌組織以及相應(yīng)癌旁組織中均有表達，在肝癌組織中的表達較癌旁組織明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）。

2.2 MALAT1與肝癌患者臨床病理因素之間的關(guān)系

為了驗證MALAT1在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，進一步分析MALAT1與肝癌臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，肝癌組織中MALAT1的表達與腫瘤大小、肝癌的分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05）；肝癌組織中MALAT1的表達與肝癌患者的年齡、性別等臨床資料之間均無關(guān)（均P＞0.05）（表1）。

圖1 MALAT1在肝癌組織與癌旁組織中表達的比較Figure 1 Comparison of MALAT1 expressions between HCC and cancer-adjacent tissue

表1 MALAT1表達與肝癌患者臨床病理因素的關(guān)系[n（%）]Table 1 Relations of MALAT1 expression with clinicopathologic factors of HCC patients [n (%)]

2.3 MALAT1對肝癌細胞增殖侵襲的影響

為探討MALAT1在肝癌細胞中發(fā)揮何種作用，在肝癌細胞中分別過表達與敲低MALAT1，并通過CCK-8與Transwell實驗觀察MALAT1對肝癌細胞增殖侵襲的影響。結(jié)果提示，過表達MALAT1后肝癌細胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移細胞數(shù)較對照組明顯升高；敲低MALAT1的表達后肝癌細胞的增殖與侵襲轉(zhuǎn)移細胞數(shù)較對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）（圖2-3）。

圖2 MALAT1過表達對SMMC-7721細胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移的影響 A：MALAT1過表達后24、48 h后細胞增殖活力較對照組明顯增加；B：MALAT1過表達后細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力較對照組明顯增強Figure 2 Influences of MALAT1 overexpression on proliferation and invasion/metastasis of SMMC-7721 cells A: Increased proliferation in SMMC-7721 cells 24 and 48 h after MALAT1 overexpression compared with control group; B: Enhanced invasion/metastasis ability in SMMC-7721 cells after MALAT1 overexpression compared with control group

圖3 敲低MALAT1表達對SMMC-7721細胞增殖與侵襲轉(zhuǎn)移的影響 A：敲低MALAT1表達后24、48 h后細胞增殖活力較對照組明顯降低；B：敲低MALAT1表達后細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力較對照組明顯減弱Figure 3 Influences of MALAT1 knock-down on proliferation and invasion/metastasis of SMMC-7721 cells A: Decreased proliferation in SMMC-7721 cells 24 and 48 h after MALAT1 knock-down compared with control group; B: Reduced invasion/metastasis ability in SMMC-7721 cells after MALAT1 knock-down compared with control group

3 討 論

肝癌是臨床上最常見的腫瘤之一，全世界范圍內(nèi)每年新發(fā)肝癌患者常年居高不下，占全世界癌癥死亡原因的第3位[1]。在我國，肝癌占癌癥死亡原因的第2位，肝癌進展快以及轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)一直是制約肝癌治療與預(yù)后的主要問題，也是肝癌在世界范圍內(nèi)發(fā)生率與病死率常年居高不下的主要原因[8]。在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中，多種基因發(fā)揮促癌作用，使得肝癌快速進展。尤其是近年發(fā)現(xiàn)的lncRNA，越來越多的證據(jù)顯示lncRNA在肝癌進展過程中發(fā)揮著不可或缺的作用[9-11]。

lncRNA是長度＞200個核苷酸的非編碼RNA，可以在轉(zhuǎn)錄水平以及轉(zhuǎn)錄后，翻譯水平調(diào)控基因表達，進而影響人體多種病理生理過程，尤其是lncRNA 在腫瘤中的作用，日益受到重視[12-15]。MALAT1屬于lncRNA家族成員，最早是在非小細胞肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)的，研究其結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn)，MALAT1沒有足夠長度的開放閱讀框，這種結(jié)構(gòu)特點決定了MALAT1不具有蛋白編碼功能，是真正意義的lncRNA[6,16-18]。近年的研究[19-23]證實MALAT1在多種腫瘤中均發(fā)揮重要的調(diào)控作用。Wang等[24]在進行膽管癌的研究時發(fā)現(xiàn)，MALAT1在膽管癌組織中表達較正常組織升高，并且MALAT1能夠促進膽管癌細胞的增殖與侵襲；Liu等[25]研究證實MALAT1能夠通過與miRNA之間相互作用，進一步通過HMGB-1實現(xiàn)調(diào)控骨肉瘤的進展；Lee等[26]的研究還發(fā)現(xiàn)MALAT1能夠促進胃腺癌侵襲。這些結(jié)果提示 MALAT1 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮促癌作用，那么在肝癌中MALAT1發(fā)揮怎樣的功能？

本研究選取85例肝癌組織標本作為研究對象，距離腫瘤組織＞5 cm的癌旁組織作為對照。通過q R T-P C R方法檢測肝癌組織以及相應(yīng)癌旁組織中MALAT1的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn) MALAT1在肝癌組織中的表達較癌旁組織中的表達升高（P＜0.05）。這一結(jié)果提示MALAT1表達與肝癌的發(fā)生關(guān)系密切，可能參與了肝癌的癌變過程。進一步結(jié)合臨床病例參數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，MALAT1在低分化，TNM分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及門靜脈浸潤肝癌患者中表達升高，提示MALAT1的表達與肝癌進展密切相關(guān)。進一步通過在細胞中驗證MALAT1在肝癌細胞中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝癌細胞過表達MALAT1后肝癌細胞增殖活力較對照組顯著增加，同時Transwell實驗提示過表達MALAT1后肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力較對照組亦顯著增強。而在肝癌細胞中敲低MALAT1的表達后，肝癌細胞的增殖活力顯著受到抑制，與對照組相比差異顯著，同樣，敲低MALAT1后肝癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移能力較對照組降低（均P＜0.05）。這些結(jié)果提示MALAT1在肝癌中發(fā)揮著促癌作用。

綜上，本研究結(jié)果證實MALAT1在肝癌中高表達，并且與肝癌的分期密切相關(guān)。同時，證實MALAT1能夠促進肝癌的侵襲轉(zhuǎn)移、發(fā)揮癌基因的作用。但是MALAT1的確切調(diào)控機制還需要進一步的細胞以及動物實驗來驗證。

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