彭小珊，蘇安梅，文輝忠，鐘青梅，陳羽燁，王益林

(廣西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 廣西生物煉制重點實驗室，廣西 南寧 530004)

1 引 言

多巴胺(Dopamine，DA)是哺乳動物體內(nèi)一種重要的神經(jīng)傳遞物質(zhì)，它在神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、腎臟及內(nèi)分泌系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用[1]。若生物體內(nèi)的DA分泌不足，會導(dǎo)致神經(jīng)肌肉失調(diào)，甚至引發(fā)帕金森氏癥、老年癡呆癥、心臟病、癲癇癥和各種精神疾病[2]。因此，DA是一些疾病檢測的重要指標(biāo)。此外，作為一種心血管藥物，DA在臨床上廣泛用于治療神經(jīng)紊亂、支氣管哮喘、高血壓及感染性休克等[3]。 因此，檢測DA既有重要的理論意義也有臨床應(yīng)用價值。目前，已報道的DA檢測方法主要有電化學(xué)法[4]、化學(xué)發(fā)光法[5]、高效液相色譜法[6]、比色法[7]及熒光法[8]等。

碳量子點(Carbon quantum dots，CQDs)是一種新型熒光探針，與傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點相比，CQDs具有制備成本低、沒有毒性、生物相容性好等優(yōu)勢，在化學(xué)分析[9-10]和生物傳感[11-12]等研究領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。文獻(xiàn)報道的CQDs制備方法很多，但一般采用人工制備的含碳化合物為原料[13-15]。近年來，一些利用天然生物質(zhì)，如蘋果汁[16]和枸杞[17]等為原料，采用綠色概念制備CQDs的方法相繼出現(xiàn)。本文以丟棄的香煙過濾嘴為原料，制備熒光強(qiáng)度高、水溶性和穩(wěn)定性好的CQDs；基于DA在堿性條件下的氧化產(chǎn)物(多巴胺醌)與CQDs發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移而使CQDs發(fā)生熒光猝滅的原理，發(fā)展一種熒光猝滅測定DA含量的分析方法，并應(yīng)用于實際樣品的測定，測定結(jié)果令人滿意。

2 實 驗

2.1 主要試劑與儀器

主要試劑有：鹽酸多巴胺(99.0%，上海畢得醫(yī)藥科技有限公司)，NaH2PO4(分析純，廣東光華科技股份有限公司)，Na2HPO4(分析純，廣東光華科技股份有限公司)，抗壞血酸、尿酸、麥芽糖、葡萄糖、乳糖、蘇氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸(分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠)，蔗糖、葡萄糖、果糖(分析純，天津登科化學(xué)有限公司)。

測試儀器包括RF-5301熒光分光光度計(島津)，UV-4802紫外可見分光光度計(尤尼柯(上海)儀器有限公司)，HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋(金壇市醫(yī)療儀器廠)，DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)。

2.2 實驗步驟

2.2.1 碳量子點的制備

本文以丟棄的香煙過濾嘴為碳源，采用水熱法制備CQDs。具體方法簡述如下：將香煙過濾嘴外邊的紙撕掉，取出過濾嘴并掰開成片狀，水洗后在烘箱中低溫(60 ℃)烘干；稱取上述過濾嘴0.40 g，放入聚四氟乙烯內(nèi)襯，加40 mL去離子水，蓋好蓋子，放入反應(yīng)釜中，將擰緊后的反應(yīng)釜放入烘箱，在200 ℃下反應(yīng)6 h后自然冷卻；收集反應(yīng)后的溶液，經(jīng)0.45 μm 的濾膜過濾后定容到250 mL備用。

2.2.2 多巴胺的測定

在系列10 mL比色管中依次加入5.0 mL磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH=8.0)、1.0 mL CQDs、1.0 mL不同濃度的DA胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分混勻，用去離子水定容到刻度后放入35 ℃的恒溫水浴鍋中培育4 h。隨后，將比色管從水浴鍋中取出并在室溫下冷卻，用RF-5301型熒光分光光度計測熒光強(qiáng)度(F)。同時做DA試劑空白(F0)。測定時激發(fā)波長選用356 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫都設(shè)置為5.0 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 碳量子點的表征

圖1是CQDs的透射電鏡及粒徑分布圖，可以看出，制備的CQDs分散性好，顆粒呈球狀，粒度分布比較均勻，尺寸介于2.8～9.6 nm之間，平均粒徑5.9 nm，與文獻(xiàn)[18]報道的CQDs粒度范圍一致。

圖1 碳量子點的透射電鏡及粒徑分布圖Fig.1 TEM image of CQDs and the corresponding size distribution histogram

圖2 碳量子點的紫外可見光譜及熒光光譜圖。插圖為在日光(左)和紫外光(右)下的實物照片。
Fig.2 UV-Vis absorption and fluorescence spectra of CQDs.Inset:photographs of the solution of CQDs taken under visible light (left) and under 365 nm UV light (right).

3.2 多巴胺對碳量子點的熒光猝滅及其機(jī)理探討

常溫下，在CQDs溶液中加入DA后其熒光強(qiáng)度沒有變化；經(jīng)低溫加熱一定時間后，DA能猝滅CQDs的熒光。圖3是在磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液中，CQDs及CQDs-DA在35 ℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)4 h后的熒光光譜?？梢钥闯?，在CQDs-DA體系中，CQDs的熒光明顯降低。研究表明，堿性條件下，DA可被O2氧化而產(chǎn)生多巴胺醌，而多巴胺醌是強(qiáng)吸電子體[22]。因此，我們認(rèn)為DA猝滅CQDs熒光的可能機(jī)理是電荷轉(zhuǎn)移，即DA被氧化后生成的多巴胺醌與CQDs激發(fā)態(tài)分子之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移而引起熒光猝滅。

圖3 加入多巴胺前后碳量子點的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of CQDs in the absent and presence of dopamine

3.3 多巴胺的測定

3.3.1 測定條件的選擇

pH值的大小既影響CQDs的熒光強(qiáng)度也影響多巴胺醌的生成。本文在磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖體系中研究了pH值對CQDs熒光猝滅的影響。圖4數(shù)據(jù)表明，在pH=6～8的范圍內(nèi)，CQDs的熒光隨pH值的升高而增強(qiáng)；而CQDs-DA體系的熒光隨pH值的升高而降低，這與堿性條件有利于多巴胺醌的產(chǎn)生一致。后續(xù)實驗選擇在pH=8.0的緩沖溶液中進(jìn)行。

DA的還原性比較強(qiáng)，但在常溫下被溶液中溶解O2氧化的速度非常慢。圖5實驗數(shù)據(jù)表明，常溫下DA對CQDs的熒光幾乎沒有猝滅作用；隨著溫度的升高，熒光猝滅逐漸增強(qiáng)，當(dāng)溫度到35 ℃后，繼續(xù)升溫則效果甚微。因此，實驗選擇在35 ℃的溫度下培育一定時間后進(jìn)行熒光測定。

圖4 不同pH值條件下加與不加多巴胺時碳量子點的熒光響應(yīng)
Fig.4 Fluorescence responses of CQDs in the absence and presence of dopamine at different pH values

圖5 溫度對熒光響應(yīng)的影響Fig.5 Temperature-dependent fluorescence response

圖6 時間對熒光響應(yīng)的影響Fig.6 Time-dependent fluorescence response

圖6是在35 ℃水浴鍋中培育不同時間后CQDs及CQDs-DA體系的熒光測定結(jié)果?？梢钥闯?，CQDs-DA體系的熒光強(qiáng)度隨反應(yīng)時間延長而明顯下降，且4小時后繼續(xù)延長時間而效果甚微。因此，實驗選擇在35 ℃水浴鍋中培育4 h后進(jìn)行熒光測定。

3.3.2 方法的分析性能

根據(jù)實驗方法，在選定的實驗條件下測定了CQDs在不同濃度DA溶液中的熒光光譜。數(shù)據(jù)表明，當(dāng)DA濃度在1.2～84.0 μmol/L范圍內(nèi)時，熒光強(qiáng)度的猝滅值與DA濃度呈良好的線性關(guān)系(圖7)，線性回歸方程為ΔF=1.08C+ 11.1 (ΔF=F0-F，C為DA濃度，單位：μmol/L) ，相關(guān)系數(shù)R2為0.996，方法檢出限(3σ/k)為0.80 μmol/L。對含36 μmol/L DA的溶液連續(xù)測定5次，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%。說明該方法的靈敏度和精密度較高，滿足微量分析要求。

圖7 熒光猝滅與DA濃度的關(guān)系Fig.7 Relationship between the fluorescence quenching and the concentration of DA

3.3.3 共存物的影響

3.3.4 分析應(yīng)用

為進(jìn)一步研究方法的實用性，收集2 名志愿者尿液用磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液(pH=8.0)稀釋5倍，取稀釋后的尿液1.0 mL，按實驗方法進(jìn)行多巴胺的回收率測定，具體結(jié)果如表1所示。可以看出，測定結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和方法回收率都在可以接受的范圍內(nèi)，該方法可應(yīng)用于實際樣品的分析。

表1 尿液樣品中鹽酸多巴胺的回收率實驗(n=5)Tab.1 Recovery of standard addition of dopamine hydrochloride in real urine samples (n=5)

4 結(jié) 論

以丟棄的香煙過濾嘴為原料制備水溶性碳量子點；基于多巴胺在堿性條件下的氧化產(chǎn)物(多巴胺醌)與碳量子點發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移而使碳量子點發(fā)生熒光猝滅的原理，發(fā)展一種熒光猝滅測定多巴胺含量的分析方法，并應(yīng)用于實際樣品的測定，測定結(jié)果令人滿意。本研究提供了一種以廢棄物為原料制備碳量子點的新方法，具有操作簡單、成本低、對環(huán)境無污染、對人體健康無害等優(yōu)勢。

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彭小珊(1992-)，女，廣西北流人，2017年于廣西大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位，主要從事環(huán)境監(jiān)測方面的研究。

E-mail:601888541@qq.com

王益林(1968-)，男，湖南邵陽人，博士，教授，2010年于廣西大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事量子點熒光材料的合成與應(yīng)用的研究。

E-mail:theanalyst@163.com

文輝忠(1966-)，男，廣西興安人，講師，1987年于廣西大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位，主要從事光譜分析方面的研究。

E-mail:gxuwen@126.com