侯明杰，張 霞，石福于，王虎成(1.草業(yè)科學(xué)國(guó)家級(jí)教學(xué)示范中心(蘭州大學(xué))，甘肅 蘭州 730020； 2.草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020)

牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原地區(qū)的特有畜種，也是“世界屋脊”著名的景觀牛種，主要分布在海拔3 500 m以上的高山草原，是青藏高原牧區(qū)人民的主要生活和經(jīng)濟(jì)來(lái)源[1]。牦牛在高寒、缺氧和枯草期長(zhǎng)達(dá)半年的嚴(yán)峻自然條件下，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期自然選擇和自身適應(yīng)已具有獨(dú)特的生物學(xué)特性[2-3]，科學(xué)認(rèn)知并利用這一神奇的物種，研究其高寒營(yíng)養(yǎng)適應(yīng)性顯得尤為必要，但因牦牛所處環(huán)境及生物習(xí)性明顯不同于普通牛，傳統(tǒng)的營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究方法在這一物種上的應(yīng)用受到限制，研究新的方法與技術(shù)顯得尤為必要。近年來(lái)，分子生物技術(shù)在動(dòng)物基因的表達(dá)及調(diào)控中的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注，而其研究主要建立在轉(zhuǎn)錄組的基礎(chǔ)上，得到完整的RNA是試驗(yàn)的關(guān)鍵。但是，動(dòng)物組織離開活體后RNA極不穩(wěn)定，極易被廣泛存在且難以消除的內(nèi)源或外源RNA酶降解，使得高質(zhì)量RNA不易獲得，故合理提取并保存組織RNA 至關(guān)重要[4-5]。在試驗(yàn)過(guò)程中，有時(shí)由于樣本量較大、提取總RNA時(shí)間較長(zhǎng)等原因，提取總RNA后不能迅速進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)， 使得提取出的總RNA必須貯存一段時(shí)間。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠海馬組織總RNA樣品可在-70 ℃下保存60 d，反復(fù)凍融3次后總RNA質(zhì)量基本不變[6]；全血RNA在37 ℃保存7 d時(shí)發(fā)生明顯降解[7]。然而，針對(duì)高寒區(qū)牦牛和本地黃?？俁NA長(zhǎng)時(shí)間保存后的質(zhì)量分析未見報(bào)道，這勢(shì)必不利于寶貴資源的高效利用。

此外，在以往的研究中，對(duì)RNA濃度及純度通過(guò)Nano-drop 2000來(lái)檢測(cè)[8]，RNA的完整性通過(guò)凝膠電泳條帶，并利用其積分光密度值(integrated optical density，IOD)或灰度值來(lái)表示RNA的含量[6,9]，研究發(fā)現(xiàn)凝膠電泳圖的IOD與電泳條帶RNA的百分含量具有正比關(guān)系[10-11]；RNA的百分含量能夠直接表現(xiàn)出RNA 28S、18S和5S比例，28S條帶亮度是18S的2倍[12-13]，且28S和18S的百分含量比接近于2∶1[14-15]，利用此優(yōu)點(diǎn)可更加直觀表示RNA各條帶百分含量及降解程度。此外，近年來(lái)，圍繞牦牛營(yíng)養(yǎng)代謝高寒適應(yīng)性研究，經(jīng)常以生活于同一生境的本地黃牛為參照對(duì)象[16]，鑒于此，本研究以天祝白牦牛及同一生境黃牛為對(duì)象，研究其組織RNA質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)以及短期和長(zhǎng)期保存RNA的質(zhì)量的變化，旨在為該區(qū)域動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)地位于甘肅省天祝藏族自治縣烏鞘嶺地區(qū)(37°12.479′ N，102°51.695′ E)，海拔3 154 m，氣候寒冷潮濕，晝夜溫差大，年均氣溫-0.1 ℃[17]。2015年9月在試驗(yàn)地選取3周歲體況相近、健康狀況良好的天祝白牦牛及本地黃牛各3頭做為供試動(dòng)物，屠宰采樣前于烏鞘嶺天然草地放牧飼養(yǎng)。

1.1.2儀器和試劑 TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(長(zhǎng)少平凡儀器儀表有限公司)；WD9413C凝膠成像系統(tǒng)(上海楚柏實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司)；DYY-6D穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；超凈工作臺(tái)(蘇凈安泰公司)；Nano-drop 2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀(Thermo公司)；-86 ℃超低溫冰箱(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)。

Trizol Universal RNA Extraction Kit購(gòu)自Invitrogen公司；6×Loading buffer，DEPC均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1胃腸道及肝腎組織采集與初級(jí)保存 前述試驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)24 h禁食后經(jīng)頸靜脈放血屠宰，分離胃(瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃)，小腸(十二指腸、空腸、回腸)，大腸(盲腸、結(jié)腸)，肝臟和腎臟組織。其中：胃組織經(jīng)冷生理鹽水沖洗后，鈍性剝離上皮層，進(jìn)一步?jīng)_洗后分裝于5 mL離心管于液氮罐速凍；每個(gè)腸段約20 cm用于腸粘膜采集，先用手術(shù)剪縱向切開腸段，冷自來(lái)水沖洗內(nèi)容物，再用生理鹽水沖洗后，置于冰冷的玻璃板，用載玻片刮取粘膜組織，粘膜分裝于5 mL離心管于液氮罐速凍；切取肝、腎實(shí)質(zhì)，冷生理鹽水沖洗后分裝于10 mL離心管，于液氮罐速凍，所有樣品于離體10 min內(nèi)完成。前述樣品經(jīng)液氮凍存，于第2天運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，以備提取RNA[18]。

1.2.2組織RNA的提取與保存 用Trizol Kit提取上述保存樣品的RNA。操作步驟：1)稱取低溫凍結(jié)的組織50～100 mg后迅速轉(zhuǎn)移至液氮預(yù)冷的研缽中，用研杵研磨組織，期間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，加1 mL Trizol試劑對(duì)組織進(jìn)行裂解；2)用力混勻至清澈，冰上放置5 min，12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至另一個(gè)1.5 mL離心管中；3)加入0.2 mL氯仿，反復(fù)振蕩搖勻，室溫靜置5 min，12 000 r·min-1，4 ℃離心15 min；4)小心吸取上層水相置于另一無(wú)菌1.5 mL離心管中，加入0.5 mL異丙醇，輕柔顛倒數(shù)次混勻，室溫靜置15～20 min，12 000 r·min-1，4 ℃離心10 min，棄上清，加1 mL 75%乙醇洗滌兩次；5)沉淀的RNA室溫自然干燥，用50～70 μL DEPC滅菌水重懸保存。整個(gè)操作過(guò)程在超凈工作臺(tái)內(nèi)冰上進(jìn)行，防止RNase污染。

1.2.3RNA品質(zhì)檢測(cè)與分析 提取的組織RNA樣品在-80 ℃保存，分別于1個(gè)月和23個(gè)月測(cè)定其濃度及降解程度。

RNA濃度：用Nano-drop 2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀檢測(cè)。

RNA的降解程度分析：取RNA樣品(23月)5 μL與2 μL上樣緩沖液混勻，在含3 μL核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣，120 V電泳30 min，測(cè)定其完整性。

凝膠電泳圖分析：利用Gel-pro軟件對(duì)凝膠電泳圖進(jìn)行分析，測(cè)定每個(gè)條帶28S、18S和5S IOD值及百分含量。

1.2.4數(shù)據(jù)計(jì)算與分析 RNA濃度以均值和標(biāo)準(zhǔn)誤表示(mean ± SD)，根據(jù)食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)標(biāo)準(zhǔn)生物樣品規(guī)則[6]，利用RE表示RNA濃度的穩(wěn)定性。即：RE=(不同保存時(shí)間的樣品濃度-初始濃度)/初始濃度，當(dāng)-15%≤RE≤15%時(shí)表明樣品濃度穩(wěn)定。RNA降解程度以28S∶18S來(lái)表示。利用SPSS 20軟件對(duì)RNA濃度，RE和28S、18S、5S百分含量進(jìn)行均值計(jì)算以及對(duì)RE和28S∶18S進(jìn)行配對(duì)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 貯存時(shí)間對(duì)牦牛及黃牛組織RNA濃度的影響

牦牛和黃牛胃部RNA在-80 ℃保存23個(gè)月后RNA不穩(wěn)定(RE>15% 或<-15%)(表1)。牦牛所有胃組織樣品RNA放置23個(gè)月后濃度均增加，而黃牛的瘤胃及瓣胃卻呈相反情況；牦牛和黃牛小腸各腸段RNA濃度變化不盡相同；其中，兩個(gè)基因型牛種空腸及牦?；啬c組織RNA相對(duì)穩(wěn)定；十二指腸RNA濃度變幅最大(RE=288.55%)。黃牛結(jié)腸RNA濃度在保存23個(gè)月后較保存1個(gè)月有所降低，濃度不穩(wěn)定；牦牛盲腸與結(jié)腸和黃牛盲腸RNA濃度有變化，但都相對(duì)穩(wěn)定；牦牛和黃牛大腸RNA在保存23個(gè)月后穩(wěn)定性存在顯著差異(P<0.05)；黃牛腎臟組織RNA相對(duì)穩(wěn)定，但黃牛肝臟、牦牛腎臟和肝臟均超出了RE所推薦的穩(wěn)定范圍。說(shuō)明不同品種、不同組織貯存時(shí)間對(duì)RNA的濃度影響不同。

2.2 貯存時(shí)間對(duì)RNA降解程度的影響

將-80 ℃保存1個(gè)月的所有組織RNA樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，圖1為隨機(jī)抽取樣品電泳圖。28S、18S兩條帶清晰，5S條帶不清晰，且28S條帶亮度約為18S條帶亮度的2倍，表明品質(zhì)良好。

2.2.1超低溫貯存23個(gè)月后牦牛及黃牛胃部組織RNA降解程度 牦牛和黃牛胃部RNA在-80 ℃保存23個(gè)月后的電泳條帶顯示，5S條帶最亮，28S和18S條帶較弱(圖2和圖3)。利用Gel-pro軟件對(duì)凝膠電泳圖分析28S、18S和5S百分含量(表2)，結(jié)果顯示：牦牛瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃28S∶18S均小于2，在0.51～0.86，且5S百分含量均高于28S；黃牛瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃和皺胃28S∶18S均小于2，在0.34～0.52，黃牛瘤胃和網(wǎng)胃5S含量高于28S，但瓣胃和皺胃5S含量低于28S。說(shuō)明牦牛和黃牛胃部RNA發(fā)生了明顯的降解，但不同品種、不同組織降解程度不同。

2.2.2超低溫貯存23個(gè)月后牦牛及黃牛小腸組織RNA降解程度 牦牛和黃牛小腸RNA經(jīng)-80 ℃保存23個(gè)月后電泳發(fā)現(xiàn)，除黃?？漳c3號(hào)樣品RNA 5S條帶比較明顯外，其他組織均不明顯，且28S條帶和18S條帶亮度沒有區(qū)別(圖4)。利用Gel-pro軟件對(duì)凝膠電泳圖分析28S、18S和5S百分含量，結(jié)果顯示，牦?？招∧c28S∶18S均接近1，說(shuō)明降解不明顯，牦牛和黃牛十二指腸RNA濃度發(fā)生了不同的變化(表3)。

表1 貯存時(shí)間對(duì)牦牛及黃牛胃腸道、肝臟和腎臟RNA濃度的影響Table 1 Effect of storage duration on RNA concentration in the gastrointestinal, liver, and kidney tissues of yak and cattle

同列不同小寫字母表示相同組織不同品種間差異顯著(P<0.05)，下表同。RE,RNA濃度的穩(wěn)定性。

Different lowercase letters indicate significant difference in the same tissue among different species at the 0.05 leve; similarly for the following tables. RE, stability of RNA concentration.

圖1 牦牛及黃牛部分組織RNA電泳圖Fig. 1 Image of electrophoresis of RNA from different tissues of yak and cattle

1，表示牦牛瘤胃RNA；2，表示黃?；啬cRNA；3，表示牦牛肝臟RNA。

1, indicate RNA from yak rumina; 2, indicate RNA from cattle ileum; 3, indicate RNA from yak liver.

圖2 牦牛及黃牛瘤胃和網(wǎng)胃RNA超低溫儲(chǔ)存23個(gè)月后的降解程度Fig. 2 Degradation degrees of RNA from rumina and reticula of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

1、2、3表示黃牛網(wǎng)胃RNA；4、5、6表示牦牛網(wǎng)胃RNA；7、8、9表示黃牛瘤胃RNA；10、11、12表示牦牛瘤胃RNA。

1, 2 and 3 indicate RNA from cattle reticula; 4, 5, and 6 indicate RNA from yak reticula; 7, 8 and 9 indicate RNA from cattle rumina; 10, 11, and 12 indicate RNA from yak rumina.

圖3 牦牛及黃牛瓣胃和皺胃RNA超低溫儲(chǔ)存23個(gè)月后的降解程度Fig. 3 Degradation degrees of RNA from omasa and abomasa of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

1、2、3表示黃牛皺胃RNA；4、5、6表示牦牛皺胃RNA；7、8、9表示黃牛瓣胃RNA；10、11、12表示牦牛瓣胃RNA。

1, 2, and 3 indicate RNA from cattle abomasa; 4, 5, and 6 indicate RNA from yak abomasa; 7, 8, and 9 indicate RNA from cattle omasa; 10, 11, and 12 indicate RNA from yak omasa.

圖4 牦牛及黃牛小腸RNA超低溫儲(chǔ)存23個(gè)月后的降解程度Fig. 4 Degradation degrees of RNA from small intestine of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

1、2、3表示黃?？漳cRNA；4、5、6表示牦牛空腸RNA；7、8、9表示黃?；啬cRNA；10、11、12表示牦?；啬cRNA；13、14、15表示黃牛十二指腸RNA；16、17、18表示牦牛十二指腸RNA。

1, 2, and 3 indicate RNA from cattle jejuna; 4, 5, and 6 indicate RNA from yak jejun; 7, 8, and 9 indicate RNA from cattle ilea; 10, 11, and 12 indicate RNA from yak ilea; 13, 14, and 15 indicate RNA from cattle duodena; 16, 17, and 18 indicate RNA from yak duodena.

表2 牦牛及黃牛胃部RNA超低溫儲(chǔ)存23個(gè)月后的降解程度Table 2 Degradation degrees of RNA from gastric tissues of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

表3 牦牛及黃牛小腸RNA超低溫儲(chǔ)存23個(gè)月后的降解程度Table 3 Degradation degrees of RNA from small intestine of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

2.2.3超低溫貯存23個(gè)月后牦牛及黃牛大腸組織RNA降解程度 牦牛及黃牛盲腸和結(jié)腸RNA在經(jīng)-80 ℃保存23個(gè)月后，經(jīng)電泳發(fā)現(xiàn),RNA 5S條帶均不明顯(圖5)。利用Gel-pro軟件分析發(fā)現(xiàn)(表4)，牦牛盲腸和結(jié)腸RNA 28S∶18S值低于黃牛盲腸和結(jié)腸，且均小于1，說(shuō)明RNA產(chǎn)生了降解。

圖5 牦牛及黃牛大腸RNA超低溫儲(chǔ)存23個(gè)月后的降解程度Fig. 5 Degradation degrees of RNA from large intestine of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

1、2、3表示黃牛結(jié)腸RNA；4、5、6表示牦牛結(jié)腸RNA；7、8、9表示黃牛盲腸RNA；10、11、12表示牦牛盲腸RNA。

1, 2, and 3 indicate RNA from cattle colons; 4, 5, and 6 indicate RNA from yak colons; 7, 8, and 9 indicate RNA from cattle ceca; 10, 11, and 12 indicate RNA from yak ceca.

2.2.4超低溫貯存23個(gè)月后牦牛及黃牛肝臟和腎臟組織RNA降解程度 牦牛及黃牛腎臟和肝臟RNA在-80 ℃保存貯存23個(gè)月后的電泳條帶5S最亮，28S和18S條帶較弱(圖6)。利用Gel-pro軟件對(duì)凝膠電泳圖28S、18S和5S RNA百分比含量進(jìn)行分析(表5)，結(jié)果顯示，牦牛及黃牛肝臟和腎臟5S RNA百分含量明顯高于18S和28S；牦牛與黃牛肝臟和腎臟28S/18S值在0.50～0.67，說(shuō)明牦牛及黃牛肝臟和腎臟RNA均發(fā)生了不同程度的降解。

圖6 牦牛及黃牛肝臟和腎臟RNA超低溫儲(chǔ)存23個(gè)月后的降解程度Fig. 6 Degradation degrees of RNA from livers and kidneys of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

1、2、3表示黃牛腎臟RNA；4、5、6表示牦牛腎臟RNA；7、8、9表示黃牛肝臟RNA；10、11、12表示牦牛肝臟RNA。

1, 2, and 3 indicate RNA from cattle kidneys; 4, 5, and 6 indicate RNA from yak kidneys; 7, 8, and 9 indicate RNA from cattle livers; 10, 11, and 12 indicate RNA from yak livers.

表4 牦牛及黃牛大腸RNA超低溫儲(chǔ)存23個(gè)月后的降解程度Table 4 Degradation degrees of RNA from large intestine of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

表5 牦牛及黃牛肝臟和腎臟RNA超低溫儲(chǔ)存23個(gè)月后的降解程度Table 5 Degradation degrees of RNA from livers and kidneys of yak and cattle after storage 23 months under ultralow temperature

3 討論

3.1 貯存時(shí)間對(duì)RNA濃度的影響

動(dòng)物組織離開活體后RNA極不穩(wěn)定，極易被廣泛存在且難以消除的內(nèi)源或外源RNA酶降解，使得高質(zhì)量RNA不易獲得，故合理采樣并保存組織RNA至關(guān)重要。此外，由于牦牛所處環(huán)境及生物習(xí)性明顯不同于普通牛，樣品獲取不易，如何將來(lái)之不易的樣品最大限度地用于科學(xué)研究，長(zhǎng)時(shí)間高效保存意義重大。李維凱等[6]研究發(fā)現(xiàn)，從海馬新鮮組織中提取的RNA的濃度最高，不同保存條件及反復(fù)凍融3次后RNA濃度均有所降低；研究發(fā)現(xiàn)[7]，從新鮮全血中提取的RNA濃度最高，不同保存溫度及保存時(shí)間的RNA濃度較新鮮提取均有所降低，但對(duì)于RNA純度，各組間反復(fù)凍融次數(shù)對(duì)RNA純度有顯著影響，而保存時(shí)間對(duì)RNA純度無(wú)顯著影響；穆龍龍等[19]利用Trizol 法從小體積全血標(biāo)本中獲取足量有效的總RNA，不同保存條件全血中所獲取的總RNA濃度存在差異，總RNA在-80 ℃下短期保存略有降解。張杰等[20]研究發(fā)現(xiàn)，在25(室溫)、4、-20、-80 ℃下放置10 min提取的總RNA質(zhì)量濃度隨放置溫度的降低而增加，放置于-80 ℃時(shí)，隨放置時(shí)間的增加，提取的總RNA濃度增加。說(shuō)明RNA保存條件及保存時(shí)間均會(huì)對(duì)RNA濃度產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，與保存1個(gè)月相比，在保存23個(gè)月后牦牛胃部和十二指腸與黃牛網(wǎng)胃、皺胃和十二指腸和肝臟RNA濃度均有不同程度的增加，可能是RNA降解產(chǎn)生增色效應(yīng)導(dǎo)致[21-22]，但牦?？漳c、回腸、腎臟和黃?；啬c、腎臟RNA濃度有所降低；并且，牦牛和本地黃牛瓣胃、空腸、盲腸、結(jié)腸和腎臟RNA在保存23個(gè)月后呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)。可能由于牦牛和本地黃牛品種不同，其代謝強(qiáng)度不同，所產(chǎn)生的內(nèi)源酶和外源酶活性不一造成。

3.2 貯存時(shí)間對(duì)RNA降解程度的影響

路俊峰等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在-80 ℃保存4個(gè)月的腫瘤組織RNA經(jīng)凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，部分組織RNA電泳條帶均不清晰，甚至無(wú)明顯條帶，RNA出現(xiàn)明顯的降解。楊秀榮等[24]研究發(fā)現(xiàn)，在低溫沒有密封儲(chǔ)存的情況下，RNA保存較長(zhǎng)時(shí)間，完整性好；-70 ℃下RNA可以保存8個(gè)月，-20 ℃下RNA可以保存4個(gè)月；在其他溫度條件下，若密封保存，4 ℃下可保存兩周，10 ℃下可保存4 d以上，20 ℃下保存3 d時(shí)條帶清晰，保存4 d時(shí)條帶模糊，30 ℃下保存2.5 d時(shí)條帶變得模糊，到3 d時(shí)全部降解，40 ℃下保存1 d時(shí)條帶清晰，保存2 d時(shí)條帶變得模糊，保存2.5 d時(shí)完全降解。毛君婷等[25]研究發(fā)現(xiàn)，提取的鴨肝臟組織總RNA在室溫保存24 h時(shí)只發(fā)生了部分降解，-20 ℃保存的RNA，經(jīng)過(guò)很長(zhǎng)一段時(shí)間后，RNA仍保持著很好的完整性；李維凱等[6]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠海馬RNA在-20 ℃及-70 ℃保存30 d和60 d以及24 h反復(fù)凍融3次后經(jīng)凝膠電泳發(fā)現(xiàn)，樣品仍有清晰的28S和18S條帶出現(xiàn)，說(shuō)明RNA完整性較好；本研究中，牦牛及黃牛胃部及肝臟和腎臟RNA在保存23個(gè)月后經(jīng)凝膠電泳，5S條帶較清晰，28S和18S條帶均不清晰，且亮度沒有差別，說(shuō)明RNA發(fā)生了明顯降解；利用Gel-pro分析發(fā)現(xiàn)，牦牛瘤胃、網(wǎng)胃、皺胃和肝臟以及黃牛瘤胃、網(wǎng)胃、皺胃和腎臟5S條帶百分含量均高于18S和28S，且28S∶18S在(1∶1.37)～(1∶2.96)，說(shuō)明牦牛和黃牛胃部RNA發(fā)生了不同程度的降解。然而，牦牛及黃牛小腸和大腸組織RNA均有28S和18S兩個(gè)清晰條帶出現(xiàn)，但18S條帶比28S亮，且牦牛小腸RNA 28S∶18S均接近1，說(shuō)明降解不明顯且存在物種和組織差異。

4 結(jié)論

高寒牧區(qū)動(dòng)物胃腸道等組織經(jīng)現(xiàn)場(chǎng)規(guī)范采樣后迅速用液氮保存，可異地保存運(yùn)輸至生物實(shí)驗(yàn)室，按一定規(guī)程可提取到高質(zhì)量的RNA樣品；常規(guī)超低溫保存1個(gè)月提取的內(nèi)臟組織RNA樣品可用于試驗(yàn)研究，但23個(gè)月常規(guī)方法保存該RNA樣品，均會(huì)產(chǎn)生不同程度的降解，但降解程度亦存在動(dòng)物基因型及組織部位的差異性；圍繞高寒區(qū)反芻家畜內(nèi)臟組織RNA樣品高效保存技術(shù)及有效保存時(shí)間需做進(jìn)一步研究。

References：

[1] 王彥星,鄭群英,晏兆莉,盧濤.氣候變化背景下草原產(chǎn)權(quán)制度變遷對(duì)畜牧業(yè)的影響:以青藏高原東緣牧區(qū)為例.草業(yè)科學(xué),2015,32(10):1687-1694.

Wang Y X,Zheng Q Y,Yan Z L,Lu T.Institutional transition of grassland property rights and its impact on animal husbandry under the background of climate changes:A case study from eastern Qinghai-Tibet Plateau.Pratacultural Science,2015,32(10):1687-1694.(in Chinese)

[2] 楊志娟,張相鋒,董世魁.甘肅臨夏農(nóng)牧交錯(cuò)區(qū)牦牛、犏牛易地育肥試驗(yàn).草業(yè)科學(xué),2015,32(1):119-124.

Yang Z J,Zhang X F,Dong S K.Study on the fattening the yak and yak-cattle crossbreed in the agro-pastoral transition zone in Linxia Prefecture of Gansu Province.Pratacultural Science,2015,32(1):119-124.(in Chinese)

[3] 羅惦,柴林榮,常生華,程云湘,侯扶江.我國(guó)青藏高原地區(qū)牦牛草地放牧系統(tǒng)管理及優(yōu)化.草業(yè)科學(xué),2017,34(4):881-891.

Luo D,Chai L R,Chang S H,Cheng Y X,Hou F J.Yak grazing management system sand optimization on the Qinghai-Tibet Plateau.Pratacultural Science,2017,34(4):881-891.(in Chinese)

[4] 王桂玲,黃東陽(yáng),劉戈飛.一種從動(dòng)物組織中提取高質(zhì)量總RNA的方法.生命科學(xué)研究,2003,7(3):275-278.

Wang G L,Huang D Y,Liu G F.An improved method of extracting high quality total RNA from animal tissues.Life Science Research,2003,7(3):275-278.(in Chinese)

[5] 杜迎彬,王志杰,楊冰,張曉華,黃倢.對(duì)蝦組織樣品中RNA的銨鹽常溫保存法及其效果.漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展,2013,34(3):88-96.

Du Y B,Wang Z J,Yang B,Zhnag X H,Huang J.Ammonium preservation of shrimp tissue RNA at normal temperature and its effects.Progress in Fishery Sciences,2013,34(3):88-96.(in Chinese)

[6] 李維凱,霍韜光,暢蓓,楊卉蕾,姜泓.保存條件對(duì)大鼠海馬組織總RNA質(zhì)量的影響.化學(xué)研究,2012,23(5):93-96.

Li W K,Huo T G,Chang B,Yang H L,Jiang H.Effect of storage condition on mass of total RNA in hippocampus of rat.Chemical Research,2012,23(5):93-96.(in Chinese)

[7] 何松哲,何慧,陳懿,陳羽,余道軍.不同保存和處理方式對(duì)全血標(biāo)本總RNA提取的影響.中國(guó)微生態(tài)學(xué)雜志,2015,27(2):223-226.

He S Z,He H,Chen Y,Chen Y,Yu D J.Effects of different preservation and processing methods on RNA isolation from whole blood.Chinese Journal of Microecology,2015,27(2):223-226.(in Chinese)

[8] 阮運(yùn)杰.DNA凝膠電泳分析系統(tǒng)研究.哈爾濱:哈爾濱工程大學(xué)碩士論文,2012.

Ruan Y J.Analysis system of DNA gel electrophoresis.Master Thesis.Harbin:Harbin Engineering University,2012.(in Chinese)

[9] 雷國(guó)華,李俊詩(shī).凝膠電泳圖像背景影響的蛋白質(zhì)含量計(jì)算方法.中國(guó)體視學(xué)與圖像分析,1999(2):97-101.

Lei G H,Li J S.Effects of the background of gel electrophoresis digital images on the quantification of proteins.Chinese Journal of Stereology and Image Analysis,1999(2):97-101.(in Chinese)

[10] 王文紅,張繼領(lǐng),銀廣悅,張龍.瓊脂糖凝膠電泳法測(cè)定廊坊地區(qū)血清蛋白正常參考值.中國(guó)煤炭工業(yè)醫(yī)學(xué)雜志,2005(9):957-958.

Wang W H,Zhang J L,Yin G Y,Zhang L.Normal reference values of serum protein with agarose gel electrophoresis in Langfang.Chinese Journal of Coal Industry Medicine,2005(9):957-958.(in Chinese)

[11] 雷國(guó)華,李俊詩(shī),周峻嶺.通過(guò)凝膠電泳數(shù)字化圖像分析蛋白含量的改進(jìn)方法.中國(guó)醫(yī)學(xué)物理學(xué)雜志,1998(3):183-185.

Lei G H,Li J S,Zhou J L.Quantitative analysis of protein with gel electrophoresis digital images.Chinese Journal of Medical Physics,1998(3):183-185.(in Chinese)

[12] 王丹丹,肖向紅,吳立舒,柴龍會(huì),張晶鈺,張建平.改良TRIzol法高效提取東北林蛙皮膚總RNA.野生動(dòng)物學(xué)報(bào),2012,33(3):127-128.

Wang D D,Xiao X H,Wu L S,Chai L H,Zhang J Y,Zhang J P.An improved TRIzol method to extract total RNA from skin tissue ofRanadybowskii.Chinese Journal of Wildlife,2012,33(3):127-128.(in Chinese)

[13] 易樂飛,穆亮亮,仲改.凡納濱對(duì)蝦總RNA完整性的正確評(píng)估.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2016,28(12):2007-2013.

Yi L F,Mu L L,Zhong G.Assessment of integrity of total RNA extrated fromPenaeusvannamei.Acta Agriculture Zhejiang,2016,28(12):2007-2013.(in Chinese)

[14] 王華,李華.保存動(dòng)物組織內(nèi)RNA的方法改進(jìn).生物技術(shù)通報(bào),2010(6):152-155.

Wang H,Li H.Improvement of methods for storing RNA of animal tissues.Biotechnology Bulletin,2010(6):152-155.(in Chinese)

[15] 王桂玲,劉戈飛,黃東陽(yáng).從動(dòng)物組織提取高質(zhì)量總RNA方法的改進(jìn).生物技術(shù)通訊,2003,14(6):512-514.

Wang G L,Liu G F,Huang D Y.An improved method of extracting high quality total RNA from animal tissues.Letters in Biotechnology,2003,14(6):512-514.(in Chinese)

[16] 王虎成.尿嘌呤衍生物排出量估測(cè)青藏高原牦牛瘤胃微生物蛋白產(chǎn)量研究.蘭州:蘭州大學(xué)博士學(xué)位論文,2009.

Wang H C.Urinary purine derivative excretion as a method for estimation of rumen microbial protein production of yak in Qing-hai Tibetan plateau.PhD Thesis.Lanzhou:Lanzhou University,2009.(in Chinese)

[17] 石福于,王毅,付曉悅,侯明杰,王虎成.不同放牧強(qiáng)度下祁連山東段草地生態(tài)系統(tǒng)氮磷計(jì)量特征.家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2017(3):61-66.

Shi F Y,Wang Y,Fu X Y,Hou M J,Wang H C.Metrological characteristics of nitrogen and phosphorus in grassland ecosystem under different grazing intensity in east of Qilian Mountain.Journal of Domestic Animal Ecology,2017(3):61-66.(in Chinese)

[18] Wang H C,Shi F Y,Hou M J,Fu X Y,Long R J.Cloning of oligopeptide transport carrier PepT1 and comparative analysis on PepT1 mRNA expression response to dietary nitrogen levels of yak (Bosgrunniens) and indigenous cattle (Bostaurus) on Qinghai-Tibetan Plateau.Journal of Animal Science，2016,94:3431-3440.

[19] 穆龍龍,趙志英,朱立.全血標(biāo)本保存條件對(duì)人總RNA提取效率的影響.北京醫(yī)學(xué),2010,32(10):837-840.

Mu L L,Zhao Z Y,Zhu L.RNA Isolation from human blood:Impacts of sample-storage condition.Beijing Medical Journal,2010,32(10):837-840.(in Chinese)

[20] 張杰,武晶晶,趙飛飛,閆宇翔,趙志強(qiáng).不同溫度和不同放置時(shí)間對(duì)總RNA提取濃度和純度的影響.實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2013(11):79-82.

Zhang J,Wu J J,Zhao F F,Yan Y X,Zhao Z Q.Effect of different temperature and different stored time on concentration and purity of total RNA isolation.Experiment Technology and Microecology,2013(11):79-82.(in Chinese)

[21] Sreevalsan T,Jr Lockart R Z,Jr Dodson M L,Hartman K A.Replication of Western equine encephalomyelitis virus.I.Some chemical and physical characteristics of viral ribonucleic acid.Journal of Virology,1968,2(6):558-566.

[22] 曾碧慧,張志剛.鹽濃度、酸堿度及DNA濃度對(duì)增色效應(yīng)實(shí)驗(yàn)的影響.實(shí)驗(yàn)室研究與探索,2001,20(1):43-45.

Zeng B H,Zhang Z G.Effect of different DNA concentration,pH value and salt concentration of solution on DNA hyperchromic experiment.Laboratory Research and Exploration,2001,20(1):43-45.(in Chinese)

[23] 路俊鋒,陳宏,吳勁松,毛穎,周良輔.不同保存方法對(duì)腦膠質(zhì)瘤和其周邊組織RNA保存的研究.中國(guó)臨床神經(jīng)科學(xué),2010,18(2):199-202.

Lu J F,Chen H,Wu J S,Mao Y,Zhou L F.Preservation of RNA for glioma tissue bank:Comparison of snap-frozen and RNA later solid tissue.Chinese Journal of Clinical Neurosciences,2010,18(2):199-202.(in Chinese)

[24] 楊秀榮,王慶容,劉惠茹.保存溫度對(duì)黃顙魚肝組織總RNA質(zhì)量的影響.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2016,44(11):258-260.

Yang X R,Wang Q R,Liu H R.Effect of storage temperature on total RNA in liver of yellow-head catfish meat.Jiangsu Agricultural Sciences,2016,44(11):258-260.(in Chinese)

[25] 毛君婷,史開志,文明,周碧君.高質(zhì)量鴨肝臟組織總RNA的提取及穩(wěn)定性測(cè)試.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2009,37(9):140-142.

Mao J T,Shi K Z,Wen M,Zhou B J.Extraction and stability test of high quality total RNA in duck liver tissue.Guizhou Agricultural Sciences,2009,37(9):140-142.(in Chinese)