梅 蘭，宋昭昭，劉 波，林志魁，林占熺(1.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 35000； .國家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 35000)

菌草是指經(jīng)過三級(jí)系統(tǒng)篩選法篩選出來的，經(jīng)試驗(yàn)證明適合用于栽培食藥用菌的草本植物，包括芒萁(Dicranopterisdichotoma)、五節(jié)芒(Miscanthusfloridulus)、綠洲1號(hào)(Arunddonax‘Lvzhou No.1’)、綠洲3號(hào)(A.donax‘Lvzhou No.3’)、巨菌草(Pennisetumsp.)等[1]。其中，綠洲3號(hào)原產(chǎn)于我國福建省福州市永泰縣[2]，現(xiàn)主要分布于我國福建、臺(tái)灣、安徽等地，以及在巴布亞新幾內(nèi)亞、斐濟(jì)、盧旺達(dá)均有種植。綠洲3號(hào)系單子葉禾本科蘆竹屬植物，植株高大直立，根系發(fā)達(dá)，為多年生叢生草本植物[2]。其莖桿直立、挺拔、中空，株高通常為7 m，莖粗約3 cm，葉長68.0～73.5 cm，葉寬6.6～8.0 cm，可分枝，每個(gè)節(jié)均能長芽[2]。

蘆竹屬(Arundo)植物是低洼鹽堿地的“先鋒植物”，主要是由于它耐旱、耐鹽堿的特性，且在貧瘠的土壤里具有一定的忍耐力[3-4]。綠洲3號(hào)作為蘆竹屬植物，是荒漠化地區(qū)恢復(fù)植被的優(yōu)良草種，在沼澤地、河灘地、河岸、沙荒或曠野地都能生長，近年來被用于福建長江地區(qū)的崩崗，內(nèi)蒙古阿拉善地區(qū)以及西藏林芝地區(qū)的防沙固沙，與巨菌草結(jié)合，當(dāng)年就可見效。綠洲3號(hào)還是栽培多種食藥用菌的優(yōu)質(zhì)栽培料，用禾本植物栽培食藥用菌可以大量節(jié)約木料，有效緩解菌林矛盾。除了可作為培養(yǎng)食藥用菌的栽培料，綠洲3號(hào)還可作為牲畜的青貯飼料，可用于生產(chǎn)乙醇、沼氣、纖維板等，同時(shí)還是優(yōu)質(zhì)的造紙?jiān)稀＞G洲3號(hào)適宜在中國南方如福建等氣候溫暖的地區(qū)種植，在寒冷的北方，如無人工覆膜、大棚遮蓋等措施很難自然越冬。在低溫條件下生長緩慢甚至停止生長，導(dǎo)致生長周期變短，產(chǎn)量及經(jīng)濟(jì)效益降低，這使得綠洲3號(hào)在北方的種植和推廣受到限制，傳統(tǒng)的育種技術(shù)暫時(shí)無法解決此難題。生物技術(shù)如轉(zhuǎn)基因、體細(xì)胞雜交等是改良綠洲3號(hào)耐寒性的有效途徑，必須首先建立綠洲3號(hào)的組織培養(yǎng)技術(shù)體系及轉(zhuǎn)基因體系。為此，對綠洲3號(hào)的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行初步研究，旨在為綠洲3號(hào)遺傳改良奠定基礎(chǔ)，以便對綠洲3號(hào)在極端環(huán)境下的推廣應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

植物材料蘆竹屬綠洲3號(hào)，由國家菌草工程技術(shù)研究中心提供。

根瘤農(nóng)桿菌菌株LBA4404感受態(tài)細(xì)胞(含有利福平抗性基因Rif)和質(zhì)粒pCAMBIA1301(含有卡那霉素抗性基因Kan)分別購買于上海北諾生物科技有限公司和上海捷蘭生物科技有限公司。該質(zhì)粒中Hyg基因?yàn)檫x擇標(biāo)記基因，GUS基因?yàn)閳?bào)告基因。

1.1 綠洲3號(hào)快繁體系的建立

1.1.1培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)條件 愈傷組織培養(yǎng)基：MS+0.5mg·L-16-BA+1.0 g·L-1PVP+3.0 mg·L-12,4-D。參考林志魁等[2]的方法。

培養(yǎng)溫度控制在(25±2)℃，光照強(qiáng)度800～1 200 lx，每天光照時(shí)間為12 h。保持培養(yǎng)室清潔及定期消毒。

1.1.2不定芽和不定根的誘導(dǎo) 在無菌條件下將培養(yǎng)的質(zhì)地相同，均勻一致的綠洲3號(hào)愈傷組織切成0.5～1 cm2的小塊，分別接種于含有不同濃度的6-BA和NAA的MS培養(yǎng)基中(表1)。每瓶中接種4塊愈傷組織，每個(gè)處理20瓶，重復(fù)3次，培養(yǎng)25 d后觀察記錄。

表1 不定芽分化和生根培養(yǎng)基配方Table 1 Medium formula of adventitious bud differentiation and rooting

1.1.3不定芽的繼代增殖 在無菌條件下將上述培養(yǎng)的長勢良好、大小一致的綠洲3號(hào)不定芽分別接種于含有不同濃度6-BA和IBA的MS培養(yǎng)基中(表2)。每瓶中接種4塊愈傷組織，每個(gè)處理20瓶，重復(fù)3次，培養(yǎng)30 d后觀察記錄不定芽增殖情況和生長狀況。

表2 不同濃度的生長素對不定芽增殖培養(yǎng)基Table 2 Different culture media used for proliferation of adventitious buds

1.1.4苗的移栽 將生長良好并長出3～4 cm根的綠洲3號(hào)組培苗從培養(yǎng)室移出，在室溫環(huán)境下閉瓶練苗3 d后，將瓶蓋打開加入水至淹沒培養(yǎng)基，繼續(xù)練苗3 d。隨后取出小苗，洗凈根部培養(yǎng)基進(jìn)行移栽。分別移栽至沙河、黃泥、菜園土、泥炭、菌糟、沙河∶泥炭(1∶2)、黃泥∶泥炭(1∶2)、菜園土∶泥炭(1∶2)、菌糟∶泥炭(1∶2)共9個(gè)基質(zhì)中，每個(gè)處理12株，重復(fù)3次。3周后統(tǒng)計(jì)成活率。

1.2 綠洲3號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步研究

1.2.1試劑配制以及培養(yǎng)基的準(zhǔn)備 頭孢酶素(Cef)、潮霉素B(Hyg)、卡那霉素(Kan)、利福平(Rif)和乙酰丁香酮(AS)分別用0.22 μm濾膜過濾滅菌后保存于-20 ℃。

LB固體、液體培養(yǎng)基，試驗(yàn)其他主要培養(yǎng)基及組成如表3所列。

表3 綠洲3號(hào)愈傷組織轉(zhuǎn)化所用的各種培養(yǎng)基Table 3 Media used in the transformation of calli of Lvzhou No. 3

MS，培養(yǎng)基；6-BA,6-芐氨基腺嘌呤; PVP，聚乙烯吡咯烷酮；AS乙酰丁香酮。

MS， culture medium; 6-BA, 6-benzylaminopurine; PVP,polyvinyl pyrrolidone； AS， acetosyringone.

1.2.2轉(zhuǎn)化受體愈傷組織的準(zhǔn)備 愈傷組織的誘導(dǎo)參考林志魁等[2]的方法。

1.2.3凍融法轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌 無菌條件下，在剛剛化凍的LBA4404農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞懸液中分別加入2 μL需要轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA和2 μL無菌水(空白對照)，輕輕混勻，冰上放置10 min。

將離心管轉(zhuǎn)入到液氮中速凍5 min，再轉(zhuǎn)移至37 ℃水浴中，放置5 min，期間不要晃動(dòng)離心管，然后冰浴5 min。無菌條件下加入800 μL不加抗生素的LB液體培養(yǎng)基，于28 ℃搖床上震蕩培養(yǎng)2.5 h，使菌體復(fù)蘇。

吸取50 μL菌液加到含有抗生素的LB固體培養(yǎng)基上，用細(xì)胞涂布器涂布均勻，對照菌液也均勻涂布于培養(yǎng)基，28 ℃倒置培養(yǎng)72 h。對長出來的菌落進(jìn)行PCR分析。

1.2.4潮霉素(Hyg)敏感性試驗(yàn) 將誘導(dǎo)出基本一致的淡黃色致密的愈傷組織分別接種到含有0、15、30、45、60、80 mg·L-1潮霉素的繼代培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接入30塊愈傷組織，3次重復(fù)。暗培養(yǎng)30 d后觀察比較不同濃度的潮霉素對愈傷組織增殖和分化的影響。綜合試驗(yàn)結(jié)果，以確定轉(zhuǎn)化過程中適合的潮霉素篩選濃度。

1.2.5頭孢霉素(Cef)抑菌濃度的確定 分別將過夜培養(yǎng)的LBA4404菌液20 μL接種到含頭孢霉素0、100、200、300、400、500 mg·L-1的液體LB培養(yǎng)基中，每個(gè)處理重復(fù)3次。在28 ℃，200 r·min-1條件下?lián)u床培養(yǎng)48 h后，觀察記錄并用分光光度計(jì)測菌液OD600值。同時(shí)將淡黃色致密的愈傷組織接種在含有0、100、200、300、400、500 mg·L-1頭孢霉素的分化培養(yǎng)基上，每個(gè)處理接入30塊愈傷組織，3次重復(fù)。光照培養(yǎng)30 d后觀察比較愈傷組織分化情況。

1.2.6農(nóng)桿菌侵染與共培養(yǎng) 挑取轉(zhuǎn)化后的農(nóng)桿菌單菌落于100 mL LB液體培養(yǎng)基(50 mg·L-1Rif+50 mg·L-1Hyg+50 mg·L-1Kan)中。28 ℃，200 r·min-1搖床上培養(yǎng)24 h，然后取一定量的菌液于燒杯中，按LB∶MS=1∶1比例稀釋菌液，使菌液OD600值調(diào)節(jié)到一定值(0.1、0.2、0.4、0.6 OD600)。

將預(yù)培養(yǎng)的愈傷組織置于上述準(zhǔn)備好的懸浮培養(yǎng)基中浸泡，期間慢慢搖動(dòng)侵染一定時(shí)間(5、10、20、30 min)后倒去菌液，用無菌濾紙吸干愈傷組織表面多余的菌液，轉(zhuǎn)接于鋪有2～3層無菌濾紙的共培養(yǎng)基中，于暗處28 ℃共培養(yǎng)一定時(shí)間(1、2、3、4 d)。

1.2.7正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)綠洲3號(hào)的轉(zhuǎn)化體系 本研究選用5因素4水平的L16(45)正交實(shí)驗(yàn)(表4)，其五因素分別是預(yù)培養(yǎng)時(shí)間(0、1、2、3 d)、菌液濃度OD600(0.1、0.2、0.4、0.6)、共培養(yǎng)AS濃度(0、100、200、300 μmol·L-1)、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間(5、10、20、30 min)及共培養(yǎng)時(shí)間(1、2、3、4 d)。試驗(yàn)參數(shù)參照預(yù)備試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)試驗(yàn)組和接種400個(gè)綠洲3號(hào)愈傷組織，共培養(yǎng)后的愈傷組織進(jìn)行GUS表達(dá)率統(tǒng)計(jì)。

表4 L16(45)正交實(shí)驗(yàn)的處理Table 4 The orthogonal experiment treatments

1.3 數(shù)據(jù)處理

不定芽誘導(dǎo)率=產(chǎn)生不定芽的愈傷組織數(shù)/接種的愈傷組織總數(shù)×100%；

不定芽生根率=分化出根的不定芽數(shù)/接種的不定芽總數(shù)×100%；

愈傷組織增殖率=增殖的愈傷組織塊數(shù)/接種的愈傷組織塊數(shù)×100%；

成活率=成活的組培苗數(shù)/移栽的組培苗總數(shù)×100%。

取以上各處理3次重復(fù)的平均值為結(jié)果數(shù)據(jù)，運(yùn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的顯著性檢驗(yàn)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠洲3號(hào)快繁體系的建立

2.1.16-BA和NAA對綠洲3號(hào)愈傷組織誘導(dǎo)不定芽和根的影響 以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的6-BA和NAA進(jìn)行芽和根分化培養(yǎng)(圖1)。結(jié)果表明，D8處理的不定芽誘導(dǎo)率顯著低于另外9個(gè)處理，不定芽的誘導(dǎo)率僅為65.000%(表5)，其他9個(gè)處理之間差異不顯著(P>0.05)，以D1和D4處理的發(fā)芽率最高，達(dá)100%，但D4的長勢差于D1。D10處理生根率顯著高于其他9個(gè)處理，為91.7%，這說明6-BA和NAA抑制綠洲3號(hào)愈傷組織根的誘導(dǎo)。綜上分析可得出，綠洲3號(hào)愈傷組織不定芽的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+1.0 mg·L-16-BA +0.1 mg·L-1NAA，根的最適誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS。

2.1.26-BA和NAA對綠洲3號(hào)不定芽增殖的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，在不添加6-BA和IBA的MS的基本培養(yǎng)基中，都沒有不定芽的增殖。在添加有6-BA和IBA的9個(gè)處理增殖明顯差異不大，增殖率均達(dá)到了100%，增殖多且長勢健壯。因此，MS+1.0 mg·L-16-BA +0.5 mg·L-1IBA為綠洲3號(hào)不定芽增殖的最佳培養(yǎng)基(圖2)。

2.1.3組培苗的移栽結(jié)果 不同移栽基質(zhì)對綠洲3號(hào)組培苗移栽成活的效果不同(圖3)。移栽成活率大小依次為泥炭(存活率為100%)>河沙∶泥炭(1∶2)>黃泥∶泥炭(1∶2)>河沙=菜園土>黃泥>菌糟∶泥炭(1∶2)>菜園土∶泥炭(1∶2)>菌糟(存活率為20.4%)；苗的長勢在含有泥炭或菌糟的土壤基質(zhì)中明顯的好于其他基質(zhì)(表6)?？梢?，泥炭基質(zhì)為綠洲3號(hào)組培苗最適移栽基質(zhì)。

圖1 綠洲3號(hào)愈傷組織誘導(dǎo)出的不定芽和根Fig. 1 Shoot and roots regenerated from Lvzhou No. 3 callus

表5 不定芽分化和生根培養(yǎng)基配方Table 5 Medium formula of adventitious bud differentiation and rooting

不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下表同。+++：生長最好最快；++：生長一般；+：生長較差。

Different lowercase letters indicate significant differences at the 0.05 level； similarly for the following tables. +++：Best; ++：Good; +：Poor.

2.2 綠洲3號(hào)的遺傳轉(zhuǎn)化

2.2.1愈傷組織增殖對潮霉素的敏感性 15～45 mg·L-1的Hyg可促使綠洲3號(hào)根分化，在不加Hyg和Hyg濃度在60～80 mg·L-1的培養(yǎng)基中均無根的分化(表7)。接種在含Hyg的培養(yǎng)基上的愈傷組織增殖塊數(shù)與不含Hyg的培養(yǎng)基相比顯著(P<0.05)下降，15～80 mg·L-1的Hyg濃度使愈傷組織的增殖塊數(shù)低于40%，在80 mg·L-1時(shí)愈傷組織增殖塊數(shù)為0(圖4)。因此，Hyg比較理想的選擇壓濃度為80 mg·L-1。

2.2.2愈傷組織分化對潮霉素的敏感性 在無Hyg添加的培養(yǎng)基中，愈傷組織中不定芽分化率較高，在含有Hyg添加的培養(yǎng)基中愈傷組織不定芽分化率為0。隨著Hyg濃度的升高，生根率先升后降且差異顯著(P<0.05)。當(dāng)Hyg濃度大于60 mg·L-1時(shí)，愈傷組織停止生長和分化，并出現(xiàn)黃褐色(圖5)。在45 mg·L-1的Hyg濃度下愈傷組織先增大后焦褐死亡(圖5)。所以，Hyg的最適濃度為60 mg·L-1。

圖2 綠洲3號(hào)芽在G10和含有激素的培養(yǎng)基上的增殖情況Fig. 2 The propagation of Lvzhou No. 3 buds was in G10 medium and the medium with hormone

圖3 移栽的植株及生長30 d后的植株Fig. 3 Transplanted seedlings and plants after 30 d

表6 不同基質(zhì)對綠洲3號(hào)組培苗移栽成活率的影響Table 6 Effect of different planting media on plantlet survival rates

++表示苗短,瘦弱；+++表示苗短,粗壯；++++表示苗長,粗壯。

++, the bud is short and weak; +++, the bud is short and strong; ++++, the bud is long and strong.

2.2.3抑菌抗生素濃度的篩選 隨著抑菌劑Cef濃度的增加，菌液OD600值顯著下降(P<0.05)。Cef分別為100、200、300、400、500 mg·L-1時(shí)，OD600值分別為0.038、0.021、0.010、0.004和0，其抑菌效果無顯著差異，且農(nóng)桿菌LBA4404的數(shù)量極少，在500 mg·L-1時(shí)能完全達(dá)到抑制農(nóng)桿菌生長(表9)。

隨著Cef濃度的增加，綠洲3號(hào)愈傷組織芽和根的分化受到的影響不大，芽的分化率均大于88%(表10)。為更好地抑制農(nóng)桿菌生長，降低試驗(yàn)成本并避免浪費(fèi)，選用Cef的抑菌濃度為200mg·L-1時(shí)，綠洲3號(hào)愈傷組織仍能高效分化出芽。由此說明，Cef可作為抑菌劑[5-7]。

2.2.4農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的結(jié)果 將經(jīng)凍融法轉(zhuǎn)化的根瘤農(nóng)桿菌菌株LBA4404分別涂抹于LB基本培養(yǎng)基和添加50 mg·L-1利福平、50 mg·L-1潮霉素及50 mg·L-1卡那霉素的LB培養(yǎng)基，同時(shí)把未經(jīng)轉(zhuǎn)化的根瘤農(nóng)桿菌菌株LBA4404涂抹于含抗生素(利福平、潮霉素、卡那霉素)的LB培養(yǎng)基，經(jīng)3 d培養(yǎng)后觀察生長情況。含有抗生素的培養(yǎng)基中未經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株LBA4404無生長的跡象，而經(jīng)轉(zhuǎn)化的菌株LBA4404在含抗生素的LB培養(yǎng)基中生長速度明顯低于在不含抗生素的LB培養(yǎng)基，因此在含抗生素的培養(yǎng)基中，菌株LBA4404成功導(dǎo)入質(zhì)粒pCAMBIA1301。

表7 不同濃度的潮霉素對愈傷組織增殖的影響Table 7 Effects of different concentrations of Hyg on callus proliferation

圖4 不同濃度的潮霉素對愈傷組織增殖的情況Fig. 4 Effects of different concentrations of Hyg on callus proliferation

表8 不同濃度的潮霉素對愈傷組織分化的影響Table 8 Effects of different concentrations of Hyg on callus differentiation

圖5 不同濃度的潮霉素對愈傷組織分化的情況Fig. 5 Effects of different concentrations of Hyg on callus differentiation

2.2.5正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果 將共培養(yǎng)的愈傷組織和未轉(zhuǎn)化處理的愈傷組織進(jìn)行GUS染色，結(jié)果表明，抗性愈傷組織表面呈藍(lán)色，經(jīng)共培養(yǎng)無抗性愈傷組織呈黃色，而未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的愈傷組織呈白色。在本研究中，當(dāng)預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3 d、OD600為0.1、添加AS濃度為300 μmol·L-1、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為10 min及共培養(yǎng)時(shí)間為1 d時(shí)，GUS表達(dá)率最高，為1.5%，其他條件均未發(fā)現(xiàn)抗性愈傷組織。

表9 頭孢霉素對抑菌效果的影響Table 9 Effect of cefotaxime on suppression of Agrobacterium tumefaciens

表10 不同濃度的Cef對愈傷組織分化的影響Table 10 Effects of different concentrations of Cef on callus differentiation

圖6 GUS表達(dá)Fig. 6 GUS expression

a: 農(nóng)桿菌侵染的愈傷組織；b:未經(jīng)農(nóng)桿菌侵染的愈傷組織。

a: Calli infected byAgrobacteriumtumefaciens; b: Calli withoutAgrobacteriuminfection.

3 討論與結(jié)論

分化與激素的關(guān)系同植物的遺傳性有密切的關(guān)系，而細(xì)胞分裂素與生長素的比值能影響植物的分化能力，從而影響愈傷組織的根、芽等器官的分化[8]。唐玉林等[9]研究表明，細(xì)胞分裂素/生長素比值高不利于根的分化，從而也證實(shí)本研究中6-BA和NAA抑制綠洲3號(hào)愈傷組織的根分化。當(dāng)添加的6-BA和NAA濃度均為0 mg·L-1時(shí)，生根率高于其他9個(gè)處理。添加1.0 mg·L-16-BA和0.1 mg·L-1NAA，愈傷組織的不定芽誘導(dǎo)率和生根率均最高，且長勢良好。許多作物器官先長出根系后很難分化出不定芽[10]，故應(yīng)先分化出不定芽后再進(jìn)行根的誘導(dǎo)。綜合分析，誘導(dǎo)綠洲3號(hào)不定芽分化的最佳培養(yǎng)基為：MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，最佳生根培養(yǎng)基為MS。

吲哚丁酸(IBA)屬于生長素類物質(zhì)，它可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)愈傷組織形成組織塊。6-BA屬于細(xì)胞分裂素類物質(zhì)，可以促進(jìn)細(xì)胞的分裂和不定芽的形成，打破頂端優(yōu)勢，有利于形成叢生芽并增殖[11]。在植物的組織培養(yǎng)中，添加的激素種類和配比對細(xì)胞的誘導(dǎo)分化與生長起著決定性的作用，在一般情況下高濃度的細(xì)胞分裂素與低濃度的生長素配合使用可直接誘導(dǎo)外植體再生不定芽或誘導(dǎo)生成胚狀體[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的6-BA和IBA均可促進(jìn)綠洲3號(hào)不定芽的增殖，在添加有6-BA和IBA的9個(gè)處理中，不定芽的增殖差異不大，且都達(dá)到了100%。結(jié)合成本考慮，以MS+1.0 mg·L-16-BA+0.5 mg·L-1IBA為最佳增殖培養(yǎng)基。

通過苗的移栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，綠洲3號(hào)組培苗移栽入9種基質(zhì)中培養(yǎng)一段時(shí)間后，除含有菌糟基質(zhì)的苗生長良好，其余的均植株矮小、葉下部成紫紅色。李曉強(qiáng)等[13]利用菌渣為原料的育苗基質(zhì)，通過加入不同體積配比的珍珠巖、蛭石，進(jìn)行番茄(Lycopersiconesculentum)、甜椒(Capsicumannuumvar.grossum)、黃瓜(Cucumissativus)的育苗，發(fā)現(xiàn)菌渣和珍珠巖復(fù)合基質(zhì)中菌渣含量與蔬菜壯苗指數(shù)極顯著相關(guān)(P<0.01)。在土壤中添加菌渣，可改變土壤有機(jī)質(zhì)、腐殖質(zhì)含量，有助于改善土壤結(jié)構(gòu)，促進(jìn)土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成，提高土壤肥力[14]。因此在育苗時(shí)，應(yīng)注意科學(xué)合理地組配無機(jī)基質(zhì)和有機(jī)基質(zhì)，可以更好地調(diào)節(jié)育苗基質(zhì)的水分和營養(yǎng)狀況。

轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)必備的條件是較強(qiáng)重復(fù)性、高頻率的再生率和誘導(dǎo)率[15]。Firoozabady等[16]利用帶GUS報(bào)告基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化Rosahybrida‘Royalty’的莖、葉柄、花、葉及愈傷組織等，結(jié)果表明,只有愈傷組織轉(zhuǎn)化成功。高莉萍和包滿珠[17]選擇月季品種‘薩曼莎’的愈傷組織和試管苗葉作為轉(zhuǎn)化受體，結(jié)果顯示,只有愈傷組織成功轉(zhuǎn)化。因此,本研究以綠洲3號(hào)愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體材料。

植物的遺傳轉(zhuǎn)化體系研究中，選擇劑既不可殺死植物細(xì)胞，又需對細(xì)胞生長起到抑制作用[18-19]。轉(zhuǎn)化受體材料對抗生素有一定耐受力，而非轉(zhuǎn)化受體材料對抗生素敏感，從而篩選出轉(zhuǎn)化成功的植株。本研究所用載體質(zhì)粒pCAMBIA1301含有潮霉素抗性，綠洲3號(hào)愈傷組織對潮霉素較為敏感，潮霉素濃度在60 mg·L-1幾乎就抑制愈傷組織的分化，在80 mg·L-1愈傷組織幾乎停止生長。因此，在綠洲3號(hào)遺傳轉(zhuǎn)化過程中，選擇60～80 mg·L-1潮霉素為適宜的選擇劑。

植物的遺傳轉(zhuǎn)化中，侵染后的受體材料表面附著有大量的農(nóng)桿菌，如果不加抗生素會(huì)使農(nóng)桿菌大量的生長，從而使受體材料死亡?？股啬苁菇?jīng)農(nóng)桿菌侵染共培養(yǎng)后的受體材料脫菌，且不影響受體材料的分化[20]。本研究采用的抑菌劑是頭孢霉素(Cef)，頭孢霉素是較為常用的抗生素。對抑菌劑的研究表明，200 mg·L-1的頭孢霉素濃度即可抑制農(nóng)桿菌的滋生，且對綠洲3號(hào)愈傷組織的分化沒有表現(xiàn)出明顯的毒害作用，與姜清彬[21]使用200 mg·L-1的頭孢霉素對細(xì)枝木麻黃(Casuarinacunninghamiana)遺傳轉(zhuǎn)化基本一致。

許多研究表明，受體材料在農(nóng)桿菌侵染之前進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)具有重要的意義，可以促進(jìn)傷口處的細(xì)胞分裂，從而使外源DNA更容易整合進(jìn)組織或細(xì)胞，有利于提高轉(zhuǎn)化效率[22]。在轉(zhuǎn)化過程中，通過預(yù)培養(yǎng)可以減少污染率，如轉(zhuǎn)化受體材料上帶有病菌等，則在預(yù)培養(yǎng)中可被篩選掉。預(yù)培養(yǎng)的時(shí)間對轉(zhuǎn)化率影響顯著，如果預(yù)培養(yǎng)時(shí)間過長，會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降，可能是由于轉(zhuǎn)化受體材料傷口的愈合。因此,本研究對綠洲3號(hào)組織分別進(jìn)行0、1、2、3 d的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間設(shè)定，從而進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)篩選,結(jié)果表明,預(yù)培養(yǎng)時(shí)間為3 d為最適時(shí)間。

農(nóng)桿菌在侵染的過程中菌液濃度過低或侵染時(shí)間過短時(shí)，會(huì)使受體材料與農(nóng)桿菌不能充分接觸，從而使轉(zhuǎn)化率降低。在菌液濃度過高或侵染時(shí)間過長時(shí)會(huì)使受體材料傷口軟腐壞死、褐化死亡，且篩選培養(yǎng)時(shí)農(nóng)桿菌不易去除，從而影響轉(zhuǎn)化率[23]。不同受體材料對菌液濃度的敏感性有一定的差異，一般菌液濃度范圍OD600在0.05～0.70之間，侵染時(shí)間掌握在數(shù)分鐘內(nèi)。本研究設(shè)計(jì)的菌液濃度OD600(0.1、0.2、0.4、0.6)及農(nóng)桿菌侵染時(shí)間(5、10、20、30 min)，而進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)篩選。結(jié)果表明篩選的最適菌液濃度OD600為0.1，最適農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為10 min。

研究表明，共培養(yǎng)是決定遺傳轉(zhuǎn)化能否成功的關(guān)鍵，農(nóng)桿菌附著在受體材料表面后不能立即轉(zhuǎn)化，只有在受體材料傷口部位生存16 h后農(nóng)桿菌才能誘發(fā)腫瘤[24]。使外源基因整合進(jìn)植物基因組中需適宜的共培養(yǎng)時(shí)間。因此，本研究需要對愈傷組織進(jìn)行共培養(yǎng)，設(shè)計(jì)共培養(yǎng)時(shí)間(1、2、3、4 d)。乙酰丁香酮(AS)廣泛應(yīng)用于農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物遺傳轉(zhuǎn)化中，是一種酚類化合物[25]。乙酰丁香酮能誘導(dǎo)農(nóng)桿菌VIr基因表達(dá)及活化，從而促進(jìn)T-DNA的轉(zhuǎn)移[26]。由于單子葉植物傷口細(xì)胞不能釋放酚類化合物，因此本研究在共培養(yǎng)基中加入AS濃度(0、100、200、300 μmoL·L-1)，而進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)篩選。結(jié)果表明,在共培養(yǎng)基中加入的最適AS濃度為300 μmoL·L-1。

關(guān)于轉(zhuǎn)化體系建立的報(bào)道已有不少，但研究者大都針對單因素試驗(yàn)的效應(yīng)開展研究各個(gè)因素的最佳水平[27]，而單因素試驗(yàn)結(jié)果的判斷缺乏一定的標(biāo)準(zhǔn)和量化，且試驗(yàn)過程繁瑣，從整體上考慮各因素的交換作用與綜合影響不能兼顧[28]。本研究以綠洲3號(hào)愈傷組織為材料，采用正交設(shè)計(jì)，對農(nóng)桿菌介導(dǎo)的綠洲3號(hào)愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系中的預(yù)培養(yǎng)時(shí)間、菌液濃度、共培養(yǎng)AS濃度、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間和共培養(yǎng)時(shí)間5因素4水平進(jìn)行系統(tǒng)研究。最終建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的綠洲3號(hào)愈傷組織轉(zhuǎn)化體系：綠洲3號(hào)愈傷組織預(yù)培養(yǎng)3 d、菌液濃度OD600測定值為0.1、共培養(yǎng)的AS濃度為300 μmol·L-1、農(nóng)桿菌侵染時(shí)間為10 min、共培養(yǎng)時(shí)間1 d為最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系。

本研究以綠洲3號(hào)愈傷組織為轉(zhuǎn)化受體，頭孢霉素(Cef)最適抑菌濃度為200 mg·L-1，潮霉素(Hyg)對愈傷組織增殖和分化最佳篩選濃度分別為80和60 mg·L-1。經(jīng)農(nóng)桿菌LBA404侵染和篩選培養(yǎng)基篩選，最后經(jīng)過GUS表達(dá)，表達(dá)率為1.5%。與發(fā)展較完善的谷子(Setariaitalica)轉(zhuǎn)基因體系和水稻(Oryzasativa)轉(zhuǎn)基因體系等相比，綠洲3號(hào)的轉(zhuǎn)基因成功率有待進(jìn)一步的提高。

References:

[1] 林占熺.菌草學(xué).第三版.北京:國家行政學(xué)院出版社,2013:4.

Lin Z X.JUNCAO Science.3rd Edition.Beijing:National School of Administration Press,2013:4.(in Chinese)

[2] 林志魁,羅宗志,梅蘭,劉宏偉,吳金壽,林占熺.蘆竹屬新材料綠洲3號(hào)的愈傷組織誘導(dǎo).草業(yè)科學(xué),2016,33(10):2012-2018.

Lin Z K,Luo Z Z,Mei L,Liu H W,Wu J S,Lin Z X.Study on callus introductions of Lvzhou No.3:A new material of arundo.Pratacultural Science,2016,33(10):2012-2018. (in Chinese)

[3] 趙麗萍,許卉.蘆竹在濱海鹽堿地的開發(fā)應(yīng)用及栽培技術(shù).北方園藝,2007(7):164-165.

Zhao L P,Xu H.The application and cultivation techniques ofArundodonaxin the coastal saline-alkali soil.Northern Horticulture,2007(7):164-165.(in Chinese)

[4] 宋宏偉,秦韌,鄭存虎.野生植物蘆竹在黃河三角洲鹽堿地的人工栽培技術(shù).當(dāng)代生態(tài)農(nóng)業(yè),2003(1):68-71.

Song H W,Qin R,Zhen C H.The artificial cultivation techniques ofArundodonaxinthe saline alkali land of Yellow River Delta.Contemporary Eco-Agriculture,2003(1):68-71.(in Chinese)

[5] 高潔.萱草再生體系的優(yōu)化及農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.成都:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2012.

Gao J.Optimization of regeneration system and establishment of agrobacterium-mediated transformation system of daylily.Master Thesis.Chengdu:Sichuan Agricultural University,2012.(in Chinese)

[6] Wang J D,Shi L,Chen X J,Zhang L,Song Y X.Removal of endosymbiosis agrobacterium from transgenic potato.Agricultural Science &Technology,2011,12(11):1576-1579.

[7] 蘇秀娟,王莉萍,代培紅,陳全家,曲延英.英國薰衣草葉盤遺傳轉(zhuǎn)化體系的創(chuàng)建.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,52(3):517-522.

Su X J,Wang L P,Dai P H,Chen Q J,Qu Y Y.Agrobacterium tumefactions-mediated genetic transformation of leaf in English Lavender.Xinjiang Agricultural Sciences,2015,52(3):517-522.(in Chinese)

[8] 崔澂.植物激素與細(xì)胞分化及形態(tài)發(fā)生的關(guān)系.中國細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào),1983,5(2):3-8.

Cui C.The relationship between plant hormones and cell differentiation and morphogenesis.Chinese Journal of Cell Biology,1983,5(2):3-8.(in Chinese)

[9] 唐玉林,陳婉芬,周燮.煙草葉塊根芽過程中內(nèi)源激素水平變化.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1996,19(2):12-16.

Tang Y L,Chen W F,Zhou X.The changes of endogenous level of plant hormones during root and bud formation in tobacco leaf explants.Journal of Nanjing Agricultural University,1996,19(2):12-16.(in Chinese)

[10] Bhaskaran S,Smith R H.Regeneration in cereal tissue culture:A review.Crop Science,1990,30:1328-1337.

[11] 吳麗芳,陸偉東,丁偉,張鴨關(guān).不同激素配比對紅掌葉片愈傷組織誘導(dǎo)的影響.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2012,38(8):17-18.

Wu L F,Lu W D,Ding W,Zhang Y G.Effect of different hormones combination on callus induction ofAnthuriumandraeanum.Guizhou Agricultural Sciences,2012,38(8):17-18.(in Chinese)

[12] 仝愛群.桑樹組培快繁技術(shù)研究.泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007.

Tong A Q.The tissue culture and the fast propagation for mulberry.Master Thesis.Tai’an:Shangdong Agricultural University,2007.(in Chinese)

[13] 李曉強(qiáng),卜崇興,郭世榮.菇渣復(fù)合基質(zhì)栽培對蔬菜幼苗生長的影響.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,37(3):517-520.

Li X Q,Bu C X,Guo S R.Effects of compound substrate of mushroom residue on growth of some vegetables seedlings.Journal of Shenyang Aricultural University,2006,37(3):517-520.(in Chinese)

[14] 梁麗紅,楊春鵬.食用菌菌糠的循環(huán)利用.蔬菜,2012(8):25-26.

Liang L H,Yang C P.The recycle utilization of spent mushroom substrates.Vegetables,2012(8):25-26.(in Chinese)

[15] 朱華芳,羅玉蘭,胡永紅,史益敏.萱草屬部分種和園藝品種的SSR多態(tài)性分柝.上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(農(nóng)業(yè)科學(xué)版),2009,27(2):143-148.

Zhu H F,Luo Y L,Hu Y H,Shi Y M.Analysis of a section ofHemerocallisspecies and varieties by SSR-PCR.Journal of Shanghai Jiaotong University(Agricultural Science),2009,27(2):143-148.(in Chinese)

[16] Firoozabady E,Moy Y,Courtneygutterson N,Robinson K.Regeneration of transgenic rose (Rosahybrid) plants from embryogenic tissue.Nature Biotechnology,1994,12:609-613.

[17] 高莉萍,包滿株.月季的植株再生及遺傳轉(zhuǎn)化研究進(jìn)展.植物學(xué)通報(bào),2005,22(2):231-237.

Gao L P,Bao M Z.Advances in plant regeneration and genetic transformation of roses.Chinese Bulletin of Botany,2005,22(2):231-237.(in Chinese)

[18] 梁美霞,許向陽,李景富.抗生素對番茄愈傷組織誘導(dǎo)和分化的影響.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2005,36(1):19-22.

Liang M X,Xu X Y,Li J F.Effect of antibiotics on the induction and differentiations of tomato callus.Journal of Northeast Agricultural University,2005,36(1):19-22.(in Chinese)

[19] 蔣衛(wèi)東.川芎組織培養(yǎng)及不同抗生素種類和濃度對川芎培養(yǎng)影響的研究.成都：四川大學(xué)碩士學(xué)位論文,2007.

Jiang W D.Studies on tissue culture and effects of different antibiotics at various concentrations on culture ofLigusticumchuanxionghort.Master Thesis.Chengdu:Sichuan Agricultural University,2007.(in Chinese)

[20] 康杰芳,王喆之.頭孢霉素類抗生素在轉(zhuǎn)基因煙草中作用的初步研究.西北植物學(xué)報(bào),2003,23(1):60-63.

Kang J F,Wang Z Z.Primary studies on function of cephalosporins antibiotics in transgenic tobacco.Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica,2003,23(1):60-63.(in Chinese)

[21] 姜清彬.細(xì)枝木麻黃再生體系及農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化研究.北京:中國林業(yè)科學(xué)研究院博士學(xué)位論文,2011.

Jiang B Q.Studies on regeneration system andAgrobacteriumtumefaciens-mediated genetic transformation inCasuarinacunninghamianamiq.PhD Thesis.Beijing:Chinese Academy of Forestry,2011.(in Chinese)

[22] 王凱,車代弟,王金剛,樊金萍.百合遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2008,39(5):39-43.

Wang K,Che D D,Wang J G,Fan J P.Establishment of genetic transformation system of Lily.Journal of Northeast Agricultural University,2008,39(5):39-43.(in Chinese)

[23] 柴燕文.PBI121-Lyz-GFP基因表達(dá)載體的構(gòu)建及其對紫花苜宿愈傷組織的轉(zhuǎn)化.蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文,2008.

Chai Y W.Construction ofPBI121-Lyz-GFPexpression vector and its expression in the callus of alfalfa.Master Thesis.Lanzhou:Gansu Agricultural University,2008.(in Chinese)

[24] 王關(guān)林,方宏筠.植物基因工程原理與技術(shù).北京:科學(xué)出版社,1998:179-634.

Wang G L,Fang H Y.Principles and Techniques of Plant Genetic Engineering.Beijing:Science Press,1998:179-634.

[25] 鄧藝,曾炳山,趙思東,劉英,裘珍飛,李湘陽,王曙.乙酰丁香酮在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化中的作用機(jī)制及應(yīng)用.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(5):2229-2232.

Deng Y,Zeng B S,Zhao S D,Liu Y,Qiu Z F,Li X Y,Wang S.Mechanism and application of acetosyringone inAgrobacterium-mediated transformation.Journal of Anhui Agricultural Sciences,2010,38(5):2229-2232.(in Chinese)

[26] Sakae S,Kanyaratt S,Masahiro M.Masaru N.Production of transgenic plants of the Liliaceous ornamental plantAgapanthuspraecoxssp. orientials (Leighton) Leighton viaAgrobacterium-mediated transformation of embryogenic calli.Plant Science,2001,161:89-97.

[27] 汪結(jié)明,項(xiàng)艷,吳大強(qiáng),孫志娟,蔡誠.楊樹ISSR反應(yīng)體系的建立及正交設(shè)計(jì)優(yōu)化.核農(nóng)學(xué)報(bào),2007,21(5):470-473.

Wang J M,Xiang Y,Wu D Q,Sun Z J,Cai C.Establishment of an ISSR reaction system for poplar and optimization using orthogonal design.Journal of Nuclear Agricultural Sciences,2007,21(5):470-473.(in Chinese)

[28] 謝運(yùn)海,夏德安,姜靜,林靜.利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化水曲柳ISSR-PCR反應(yīng)體系.分子植物育種,2005,3(3):445-450 .

Xie Y H,Xia D A,Jiang J,Lin J.Optimization for ISSR-PCR system ofFraxinusmandshuricaRupr. using orthogonal design.Molecular Plant Breeding,2005,3(3):445-450.(in Chinese)