張 林 ，周劍光，吳 濤

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223；2.武漢輕工業(yè)大學(xué)，武漢 430023)

NADPH氧化酶主要存在于中性粒細(xì)胞及其它吞噬細(xì)胞的細(xì)胞膜上，能夠產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，具有殺菌作用，并參與宿主細(xì)胞的免疫應(yīng)答[1]。NADPH氧化酶是一種高度調(diào)節(jié)的多亞基氧化酶復(fù)合體[2]，它的組裝與激活需要胞質(zhì)亞基p47phox、p40phox、p67phox磷酸化與激活，活化的催化亞基p47phox與p40phox轉(zhuǎn)移到胞膜與胞膜亞基gp91phox及p22phox結(jié)合并組裝成NADPH氧化酶全酶。當(dāng)有適當(dāng)外源物刺激時(shí)，NADPH氧化酶就被轉(zhuǎn)錄激活。其中胞質(zhì)亞基p47phox、p40phox在激活NADPH氧化酶中發(fā)揮著重要的作用[3-6]。

人(Homosapiens)[7]、鼠(Musmusculus)[8]、野牛(Bisonbison)[9]和海豚(Tursiopstruncatus)[10]NADPH氧化酶的5個(gè)亞基均已被克隆和描述。魚類NADPH氧化酶的5個(gè)亞基的cDNA也已從紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)[11]、鯉(Cyprinuscarpio)[12]、翹嘴鱖(Sinipercachuatsi)[13]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、大西洋鮭(Salmosalar)、香魚(Plecoglossusaltivelis)和斑馬魚(Daniorerio)中克隆出來(lái)。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中僅見(jiàn)到大西洋鮭(Salmo salar)的gp91phox、p47phox、p67phox亞基的cDNA全序列的報(bào)道?？梢?jiàn)對(duì)其他魚類NADPH氧化酶的研究還較少。

草魚(C.idellus)在我國(guó)分布廣泛，是非常重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類。然而，疫病是限制草魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素之一。鑒于NADPH氧化酶能生成用于清除病原微生物的活性氧，在機(jī)體的防御體系中起著非常重要的作用，而迄今還未發(fā)現(xiàn)有關(guān)草魚NADPH氧化酶p47phox、p40phox基因的相關(guān)報(bào)道。本研究克隆了草魚NADPH氧化酶的2個(gè)重要調(diào)節(jié)亞基p47phox和p40phox基因，并對(duì)其編碼的氨基酸序列進(jìn)行了分析，同時(shí)對(duì)這2個(gè)亞基在草魚不同組織中的差異表達(dá)情況檢測(cè)，以期了解NADPH氧化酶在魚類免疫調(diào)節(jié)中的作用及為魚類疾病爆發(fā)的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用草魚體重200 g左右，來(lái)自中科院水生生物研究所關(guān)橋養(yǎng)殖場(chǎng)。運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，暫養(yǎng)5 d，恒溫(20±2)℃，空氣充氧，暫養(yǎng)過(guò)程中每天投喂一次人工飼料。Trizol試劑購(gòu)自Invitrogen 公司；Ex-Taq聚合酶、DL-2000 Marker、pMD-18Tvector均購(gòu)自TaKaRa公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit：購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；iQTM SYBR?Green Supermix：購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)mego公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中斑馬魚和鯉魚的NADPH氧化酶p40phox和p47phox亞基cDNA序列保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物，擴(kuò)增中間片段，RACE擴(kuò)增所需特異性引物根據(jù)擴(kuò)增出來(lái)的中間片斷設(shè)計(jì)，熒光定量PCR擴(kuò)增所需引物根據(jù)全長(zhǎng)cDNA序列設(shè)計(jì)。所有引物均由上海生工生物公司合成(表1)。

表1 克隆及檢測(cè)草魚NADPH氧化酶p40phox和p47phox亞基的引物Tab.1 Primers used in cloning and decting p40phox and p47phox subunit of NADPH oxidase of C.idellus

續(xù)表1

注：R：A/G;Y：C/T;M：A/C;K：G/T;S：C/G;W：A/T;B：C/G/T;D：A/G/T;H：A/C/T;V：A/C/G.

1.3 RNA的提取和SMART cDNA的合成

取草魚頭腎和脾臟混合，按Trizol試劑盒說(shuō)明書介紹的方法提取混合組織的RNA。瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的質(zhì)量。按照Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit方法進(jìn)行第一鏈cDNA合成。具體操作按說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 各亞基中間片段及全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增

根據(jù)表1所列引物，以第一鏈cDNA做為模板，先用簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增出基因的cDNA片段，再根據(jù)各個(gè)基因?qū)?yīng)的特異性引物，用5′-RACE引物和SMART5′錨定引物(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGG-3′)擴(kuò)增基因的5′端，用3′-RACE引物和SMART 3′錨定引物(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACT30VN-3′)擴(kuò)增基因的3′端。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆、測(cè)序后，拼接基因的5′端和3′端序列，獲得各基因的全長(zhǎng)cDNA序列。

1.5 基因的氨基酸推測(cè)和序列比較分析

將測(cè)序所得到的cDNA序列用NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)的BLASTN、BLASTX和TBLASTX軟件進(jìn)行同源基因的搜索，查找與其相關(guān)的同源序列；氨基酸序列的推斷和疏水性分析通過(guò)ExPASy網(wǎng)站上(http://www.expasy. org/)的軟件完成；氨基酸序列同源性比較由ClustalW2.1程序完成。結(jié)構(gòu)域分析用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de)預(yù)測(cè)。

1.6 不同組織的差異表達(dá)分析

用實(shí)時(shí)熒光PCR方法定量分析草魚NADPH氧化酶2個(gè)調(diào)節(jié)亞基在草魚組織表達(dá)分布的狀況，檢測(cè)和分析方法參照文獻(xiàn)[14]。分別提取健康草魚胸腺、心、頭腎、鰓、腸、肝、腎、脾和皮膚中的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。用Real-time PCR引物擴(kuò)增各基因序列(表1)，PCR產(chǎn)物用DNA膠純化試劑盒純化后克隆進(jìn)入載體pMD18T。質(zhì)粒DNA經(jīng)純化后用于制作標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，曲線的斜率應(yīng)在-3.6與-3.2之間，相關(guān)系數(shù)應(yīng)大于0.96。以草魚各組織樣品cDNA為模板，進(jìn)行熒光定量PCR，PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件與上述建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致。利用CFX96TM Real-Time System(BIO-RAD)自帶CFX Manager軟件觀察熒光定量的結(jié)果以及數(shù)據(jù)的導(dǎo)出，通過(guò)Excel工具計(jì)算目的基因與內(nèi)參基因拷貝數(shù)比值來(lái)確定草魚p47phox和p40phox基因mRNA水平的相對(duì)表達(dá)量，即以相對(duì)于內(nèi)參基因β-actin的歸一化認(rèn)定值表征目的基因的表達(dá)水平。每樣品重復(fù)3次，結(jié)果計(jì)算采用Livak的2-ΔΔCT方法[15]。

2 結(jié)果

2.1 草魚p47phox和p40phox基因cDNA全長(zhǎng)的克隆及特征

取草魚頭腎和脾臟混合，提取RNA，以反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板，通過(guò)簡(jiǎn)并引物進(jìn)行巢式PCR，獲得大小為703 bp的p47phox片段和大小為875 bp的p40phox片段;通過(guò)5′RACE-PCR擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度為774 bp的p47phox5′端片段和長(zhǎng)度為182 bp的p40phox5′端片段；通過(guò)3′RACE-PCR擴(kuò)增，獲得大小為486 bp的p47phox 3′端片段和1 335 bp的p40phox 3′端片段，PCR產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2 。對(duì)所獲得的片段進(jìn)行拼接，得到大小為1 589 bp的p47phox亞基cDNA全長(zhǎng)序列，ORF為1 233 bp，5′UTR長(zhǎng)度為49 bp，3′UTR長(zhǎng)度為307 bp，包含加尾信號(hào)和25 bp的poly(A)尾各1個(gè)，無(wú)mRNA不穩(wěn)定信號(hào)。由cDNA序列推斷：p47phox亞基編碼由410個(gè)氨基酸組成的肽鏈，預(yù)測(cè)其相對(duì)分子質(zhì)量為47.77×103，理論pI為8.08。同時(shí)得到大小為2 103 bp的p40phox亞基cDNA全長(zhǎng)序列，ORF為1 068 bp，5′UTR長(zhǎng)度為28 bp，3′UTR長(zhǎng)度為1 007 bp 包括1個(gè)29 bp的加尾信號(hào)、5個(gè)poly(A)尾，無(wú)mRNA不穩(wěn)定信號(hào)。由cDNA序列推斷：p40phox亞基編碼由355個(gè)氨基酸組成的肽鏈，預(yù)測(cè)其相對(duì)分子量為45.68×103，理論pI為7.83。由2個(gè)cDNA序列推斷的肽鏈序列均無(wú)信號(hào)肽和跨膜區(qū)，因此推斷草魚p47phox/p40phox為非分泌型蛋白。

圖1 草魚p47phox同源片段、5′RACE、3′RACE電泳圖Fig.1 Electrophoresis results of homologous fragment，5′RACE，3′RACE of p47phox in C.idellusM:DL2000 marker；1:p47phox同源片段PCR產(chǎn)物；2:5′RACE—PCR產(chǎn)物；3:3′RACE—PCR產(chǎn)物

圖2 草魚p40phox同源片段、5′RACE、3′RACE電泳圖Fig.2 Electrophoresis results of homologous fragment，5′RACE，3′RACE of p40phox in C.idellusM:DL2000 marker；1:p40phox同源片段PCR產(chǎn)物；2:5′RACE—PCR產(chǎn)物；3:3′RACE—PCR產(chǎn)物

2.2 草魚與其他動(dòng)物的對(duì)應(yīng)調(diào)節(jié)亞基的氨基酸序列比對(duì)

用BLAST程序?qū)Σ蒴~NADPH氧化酶2個(gè)調(diào)節(jié)亞基p47phox/p40phox編碼的肽鏈進(jìn)行同源性比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：草魚NADPH氧化酶2個(gè)調(diào)節(jié)亞基與團(tuán)頭魴、鯉魚和斑馬魚的同源亞基的氨基酸序列同源性在81%～96%之間，而與墨西哥脂鯉、大西洋鮭和白斑狗魚等魚類對(duì)應(yīng)亞基同源性在68%～74%之間。推斷p47phox亞基含有1個(gè)PX 結(jié)構(gòu)域(Val6-Glu123)、2個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域(Ser162-Pro214；Leu232-Arg284)、1個(gè)PC基序(motif)(Pro354-Gln408)。P40phox亞基含有PX結(jié)構(gòu)域(Asn19-Gln140)、SH3結(jié)構(gòu)域(Arg170-Ile223)、PB1結(jié)構(gòu)域(Ser249-Ala344)各1個(gè)。p47phox和p40phox編碼肽鏈同源性比對(duì)及功能域分析結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。另外，通過(guò)CLUSTAL比對(duì)顯示這兩個(gè)亞基的結(jié)構(gòu)域與人、鼠、野牛等哺乳動(dòng)物對(duì)應(yīng)的亞基蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)基本上匹配，說(shuō)明這些亞基的功能與哺乳動(dòng)物對(duì)應(yīng)的亞基相似。

圖3 草魚p47phox同源比對(duì)結(jié)果及功能域分析Fig.3 Alignment of p47phox amino acid sequences of C.idellus and the function domain analysis箭頭分別指示PX結(jié)構(gòu)域、2個(gè)SH3結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)及PC motif，假定的p67phox結(jié)合位點(diǎn)。

2.3 p40phox和p47phox亞基在草魚不同組織中差異表達(dá)分析

通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR分析：NADPH氧化酶2個(gè)調(diào)節(jié)亞基p47phox和p40phox在草魚胸腺、心、頭腎、鰓、腸、肝、腎、脾和皮膚等不同組織中的表達(dá)強(qiáng)度不同(圖5)。在9種組織中都能檢測(cè)到這兩種亞基的表達(dá)。其中p47phox基因在皮膚，心臟和胸腺中表達(dá)最高，其次是鰓，肝臟，脾臟和頭腎，但不同組織之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。p40phox在心臟、胸腺和皮膚中表達(dá)最高，其次是腸、頭腎、脾臟，在肝、鰓和腎中也有表達(dá)，但不同組織之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)。

圖4 草魚p40phox同源比對(duì)結(jié)果及功能域分析Fig.4 Alignment of p40phox amino acid sequences of C.idellus and the function domain analysis箭頭分別指示PX結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域及PB1結(jié)構(gòu)域的結(jié)合位點(diǎn)。

圖5 p47phox和p40phox在草魚不同組織中的mRNA水平分析Fig.5 Analysis of mRNA level about p47phox and p40phox gene of different tissues in C.idellus

3 討論

本研究通過(guò)同源性比對(duì)設(shè)計(jì)引物，結(jié)合RT-PCR與RACE-PCR技術(shù)，克隆獲得草魚NADPH氧化酶2個(gè)調(diào)節(jié)亞基p47phox和p40phox基因的cDNA全長(zhǎng)序列，通過(guò)軟件分析，發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的氨基酸序列具有Nox/Duox家族蛋白特征結(jié)構(gòu)域，即N端PX結(jié)構(gòu)域、SH3結(jié)構(gòu)域、PC基序和PB1結(jié)構(gòu)域，這些結(jié)構(gòu)域與NADPH氧化酶抗菌免疫功能相關(guān)[16]。對(duì)這些結(jié)構(gòu)域的分析，為我們下一步研究其免疫功能奠定基礎(chǔ)。而且這些結(jié)構(gòu)域與人、鼠、野牛、海豚等哺乳動(dòng)物對(duì)應(yīng)的亞基蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)域和功能結(jié)合位點(diǎn)基本上吻合，說(shuō)明這些亞基在魚類中的功能與哺乳動(dòng)物對(duì)應(yīng)的亞基相似，但有待進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。氨基酸序列比對(duì)分析表明所克隆得到草魚的p47phox和p40phox基因與其他物種具有較高的同源性，這說(shuō)明NADPH這兩個(gè)亞基在進(jìn)化上相當(dāng)保守，同時(shí)也表明物種分類關(guān)系與進(jìn)化地位相匹配。

Nox/Duox家族蛋白結(jié)構(gòu)特征中的PX結(jié)構(gòu)域是維持其激活功能的關(guān)鍵位點(diǎn)，如Arg57、Arg58、Tyr59、Arg105[16-17]在草魚中也存在，這幾個(gè)關(guān)鍵位點(diǎn)如果缺失或突變，NADPH氧化酶將無(wú)法發(fā)揮抗菌免疫調(diào)節(jié)功能[17]。人類的p40phox與p47phox亞基的PX結(jié)構(gòu)域能選擇性識(shí)別PtdInsP3和PtdInsP2，然后被磷酸化，并被激活，組裝，活化后的p40phox與p47phox由細(xì)胞質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜上，相互作用后進(jìn)而裝配成有活性的NADPH氧化酶多酶復(fù)合體，發(fā)揮催化功能，促使ROS產(chǎn)生[17-18]。人類的p40phox的SH3結(jié)構(gòu)域能與磷酸化后的p47phox C端的PRR結(jié)構(gòu)域相互作用，PC基序也能與p67phox相互作用，然后3個(gè)催化亞基p40phox 、p47phox 與p67phox 相互作用并以1∶1∶1比例結(jié)合在細(xì)胞膜上形成復(fù)合體，發(fā)揮NADPH氧化酶的催化功能，促使ROS的產(chǎn)生[6]。草魚p40phox與p47phox具有類似于人的PX和SH3結(jié)構(gòu)域。由此推斷草魚與人的NADPH氧化酶亞基都擁有相似的活化機(jī)制。

胡寶慶等[13]通過(guò)半定量PCR分析了翹嘴鱖p47phox和p40phox在各種組織中的分布表達(dá)情況，這與我們?cè)诓蒴~中所得到結(jié)果有所不同。一方面可能是所用方法不同，Real-time RCR相對(duì)更靈敏、準(zhǔn)確、可靠。另一方面可能是p47phox和p40phox調(diào)節(jié)亞基mRNA在不同物種中組成型表達(dá)情況有所不同。因?yàn)椴煌锓N在不同生長(zhǎng)階段如幼魚或成魚階段，p47phox和p40phox基因在不同組織中分化不同，豐度不同，因此表達(dá)量不同。在本研究中，所采用的是200 g左右的魚，而胡寶慶等[13]是用400 g左右成魚，因此p47phox和p40phox表達(dá)量存在差異。其次魚體在不同飼養(yǎng)環(huán)境中如水質(zhì)或溫度中，魚類為維持自身的免疫穩(wěn)態(tài)，各組織發(fā)揮的免疫功能不同因而表達(dá)量有所差異。然而，本研究與鯽、紅鰭東方鲀的表達(dá)模式基本相吻合[18]?？赡苁且?yàn)轸~類的胸腺、頭腎這兩個(gè)重要的免疫組織含有豐富的吞噬細(xì)胞，同樣作為造血組織的心臟也可能NADPH氧化酶表達(dá)量高[19]。皮膚、腸作為魚類主要的黏膜相關(guān)淋巴組織，也含有較為豐富的吞噬細(xì)胞[20-21]。這些吞噬細(xì)胞都能夠產(chǎn)生NADPH氧化酶，從而促進(jìn)呼吸爆發(fā)[22-23]，而發(fā)揮抗菌免疫作用。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)p47phox和p40phox在各組織中分布表達(dá)略有差異，但是差異不顯著，這可能是機(jī)體的免疫狀態(tài)和各亞基基因的轉(zhuǎn)錄時(shí)間差異造成的。

本研究證明所克隆獲得的草魚p47phox和p40phox與團(tuán)頭魴、鯉、斑馬魚p47phox和p40phox基因具有較高的同源性，分析了草魚p47phox和p40phox基因在各個(gè)組織器官中的表達(dá)分布情況。以期能夠?yàn)榻沂緋47phox和p40phox在抗菌免疫反應(yīng)及對(duì)免疫相關(guān)基因的調(diào)控作用奠定研究基礎(chǔ)。

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