程 飚

創(chuàng)傷始終伴隨人類社會的發(fā)展過程，創(chuàng)傷外科的治療概念也始終在不斷的發(fā)展和進步，再生醫(yī)學給創(chuàng)傷外科的組織或器官理想修復帶來無限的遐想。當前再生醫(yī)學的研究熱點多集中在干細胞、組織工程等方面，作為再生醫(yī)學構成的重要部分——生物活性因子，理應受到更大的關注，它不僅直接參與(干)細胞增殖、遷移、分化活動，并與組織工程材料血管化、微環(huán)境緊密相關。生物活性因子種類繁多，目前臨床上使用的人工合成生物活性因子多僅限于外用，體內應用的安全性尚無定論，且生物效應單一，缺乏“綜合”、“瀑布式”的效果。體內本身存在一種可釋放多種生物學活性物質的細胞——血小板，當其濃縮后再活化所產生的多重生物學效用更加顯著，越來越受到創(chuàng)傷組織與再生領域學者們的青睞與關注[1]。

血小板作為一種分泌型細胞，平時處于休眠狀態(tài)，當組織受損后，其首先在損傷部位發(fā)生聚集，隨后形態(tài)改變，通過胞吐方式釋放顆粒，包含多種活性物質。既往人們關注的是血小板在血栓和止血中的作用。近些年來研究發(fā)現(xiàn)，除傳統(tǒng)的止凝血作用，血小板釋放的活性物質還參與體內組織損傷修復和再生的過程。特別是集中在生長因子方面，主要包括轉化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、血小板衍生生長因子(plateletderived growth factor,PDGF)、胰島素樣生長因子-Ⅰ(insulin-likegrowth factor-Ⅰ,IGF-Ⅰ)、骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)等。隨著人們對血小板在組織修復中所扮角色的深入認識，事實上發(fā)現(xiàn)，它可分泌十幾類上百種的活性分子，如趨化因子(chemokines)、細胞因子(cytokines)、細胞骨架蛋白(cytoskeletal proteins)、氧化應激酶(如NADPH)等，甚至凋亡蛋白。這些產物激活炎癥細胞(巨噬細胞等)、血管內皮細胞、間充質干細胞和成纖維細胞等，不僅促進壞死組織的降解和移除，而且參與新生組織的再生調控[2]。而血小板體外濃縮后再應用時以上這些作用更加顯著[1]。

1 有關濃縮血小板的命名與定義

目前有關濃縮血小板的命名紛繁復雜[3]，較為流行的如富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)和富血小板纖維蛋白(platelet rich fibrin,PRF)，甚至被人為的定義為一代、二代產品。另外，還有濃縮生長因子(concentrate growth factors，CGF)、富血小板濃縮液(platelet-rich concentrate,PRC)、濃縮的富血小板血漿(concentrated platelet-rich plasma,cPRP)、富集血小板血漿(platelet-enriched plasma,PeRP)、血小板膠(platelet gel， PG)、血小板釋放生長因子(platelet-released growth factors,PRGF)、富含生長因子的血漿(plasma rich in growth factors,PRGF)、改進型PRF(advanced PRF,A-PRF)、含白細胞的富血小板血漿或纖維蛋白(leukocyte- and platelet-rich plasma/fibrin,L-PRP/L-PRF)(leucocyte-platelet-rich)、純富血小板血漿或纖維蛋白(pure platelet-rich plasma /fibrin,P-PRP/ P-PRF)。諸多的稱謂不利于濃縮血小板在臨床上廣泛、合理和科學使用。

首先，各類濃縮血小板產品所含生物活性成分(特別是生長因子)的濃度相差幾倍甚至更高。PRP最早出現(xiàn)在1965年，當時關注的是血小板吞噬與聚合作用。因此，PRP的定義依然停留在20世紀60年代，將超過血液中血小板均值3～5倍的濃縮血小板稱為PRP，更有人將其設定為6～8倍。應該說，伴隨濃縮血小板濃度、活性與功能關系的深入認識，這一概念明顯滯后，也不夠嚴謹。諸多研究顯示，不同濃度血小板在不同細胞和組織中的作用迥異。當前所用濃縮血小板產品應該是單位體積(每mL)條件下，功能完備的血小板數(shù)量(number of platelets/mL)≥106才能發(fā)揮強大的組織修復與再生作用。濃度只是眾多問題中的一部分。

另一方面，不同的制備方法得到的濃縮血小板產品所包含的活性成分和生物學效用大相徑庭。所涉及的不僅僅是所含生物活性產物構成比，且立體的分子構象千差萬別，發(fā)揮的生物學作用也各有千秋[4]。傳統(tǒng)的PRP血漿成分中的纖維素、纖連蛋白及粘連蛋白是良好的細胞黏附分子，可作為生長因子的載體應用于某些特定類型損傷的修復。而PRF與傳統(tǒng)的PRP四分子結構不同，多經過緩慢自然聚合，產生纖維蛋白為三分子立體網狀結構，其凝膠組織較為疏松、孔隙大、彈性高，有利于組織細胞及循環(huán)血中的干細胞快速長入，細胞/生長因子被大量的滯留，并與纖維蛋白發(fā)生化學鍵結合。PRF的纖維蛋白構成(干)細胞附著、遷移，以及分化提供所需的微環(huán)境，并能充分發(fā)揮多因子間的協(xié)同作用。PRF纖維蛋白基質內所含免疫細胞的數(shù)量調控炎癥反應。CGF則富含紅細胞、血小板以及鐵、鈣和其他基本元素，多制備1～2mm的微粒用于組織受損后的缺損與腔隙，起著充填、支撐作用，也可用于粘合傷口。在組織工程中，CGF可加速移植生物材料的融合與重塑，減少感染機會，其獨特的三維結構充分發(fā)揮所含生長/細胞因子的協(xié)同效用，纖維蛋白原和纖維蛋白降解產物可促進中性粒細胞的遷移，并參與噬菌、免疫調控和酶降解過程。同時，在組織損傷時，不僅引導損傷組織的再血管化、免疫調控，還能捕獲循環(huán)血中的干細胞，參與組織修復與再生，甚至與其他生物材料混合后，參與組織損傷后再生微環(huán)境的構成。

隨著對影響濃縮血小板產品中血小板數(shù)量因素、活化后成分構成差異、空間構造和不同功能認識的深入，以及其應用范圍和模式不斷拓展與改變，對濃縮血小板治療技術應有全面創(chuàng)新性的思考。以往眾多的命名各有特點，但都離不開“濃縮”“富集”的基礎，針對不同組織(骨、軟骨、肌肉、脂肪、皮膚等)、不同目的(增殖、遷移、促分化、充填/支架、血管化、吞噬、氧化-還原應激)可能需要不同形式的濃縮血小板，因此稱之為濃縮血小板治療(enriched platelet therapy or enriched platelet treatment,EPT)技術更為合理[5]。作為這項治療技術，PRP、PRF、濃縮生長因子(CGT)等都是它的內涵，且可根據(jù)組織損傷后修復所需啟動的信號通路和關鍵蛋白，選擇合適形式的濃縮血小板產品(是否含中性粒細胞或淋巴，是否外源或體內激活等)，對進一步豐富治療手段，提高臨床治療效果具有重大意義。

2 創(chuàng)傷外科應用中濃縮血小板可能涉及的機制

骨組織損傷后，濃縮血小板中的多種生長因子具有促骨干細胞的增殖，以及間充質干細胞的遷移與轉化；增加Ⅰ、Ⅲ膠原表達，促進骨骼系統(tǒng)再生[6]。同時，濃縮血小板血漿凝膠結構為大量的纖維交織，其所形成的支架含大量孔隙，且彼此相通，孔徑為200～1 000μm，孔隙率80%，對于制備骨的組織工程支架材料十分有益。軟骨組織受損后，自身再生修復能力極弱[7]。濃縮血小板所含豐富的生長因子及其組織再生的“必備因子”，可為軟骨細胞生存提供良好微環(huán)境，促進軟骨再生[8]，甚至對椎間盤的損傷后再生有較好的作用。肌肉組織受損后，不同濃縮血小板產品(PRP和PRF)可促進肌肉干細胞增殖分化，維持其多能性；募集、激活和動員衛(wèi)星細胞和巨噬細胞，促進成肌細胞分化及血管生成，加速損傷部位愈合，并提高收縮強度，加速肌肉恢復，并在膠原降解沉積過程中發(fā)揮作用[9]。濃縮血小板治療肌腱損傷的機制可能涉及通過氧化應激產生短暫的炎癥反應、啟動再生信號通路；刺激肌腱細胞外基質分子基因表達，直接促進肌腱細胞分化和血管生成；激活并募集外周循環(huán)來源的干細胞；增強血管化和代謝活性；促進干細胞向肌腱細胞的分化并增強肌腱組織生物力學性能。但肌腱修復所需最佳血小板濃度和白細胞組分參與與否尚無明確定論，不同臨床試驗的結果迥異[10]。神經組織損傷后，濃縮血小板具有提高神經特異性烯醇和膜相關蛋白-2、神經細胞黏附分子、突觸蛋白的作用，可促進脂肪干細胞向神經分化；血漿及細胞因子和多種蛋白質可營養(yǎng)神經；直接促進雪旺氏細胞增殖，促進其分泌神經營養(yǎng)因子和膠質細胞營養(yǎng)因子，加速神經修復；一些生長因子可直接促進軸突生長與再生、大腦皮質和脊髓生長[11]。當皮膚損傷后，濃縮血小板釋放的多種蛋白質可調節(jié)炎癥反應，促進傷口修復啟動、皮膚成纖維細胞增殖與分化、肉芽組織增生、傷口收縮、血管增殖與遷移，有助于新血管生成；提高膠蛋白和纖連蛋白表達，抑制細胞外基質降解，激活大量的纖維蛋白構成皮膚支架，是維持細胞增殖生長的必要條件；促進角質形成細胞周期蛋白和周期素依賴蛋白激酶表達，加速再上皮化，具有一定的抗感染能力[12]；甚至有希望利用濃縮血小板將皮膚的修復向完美再生過渡，生成的皮膚不僅僅是覆蓋的結構，而且有分泌和代謝(汗腺、皮脂腺等)的功能[13]。

特別要提出的是其對神經的作用不僅僅表現(xiàn)在對促進神經自身的修復與再生，而且能降低受損組織的神經過度興奮，控制與恢復受損區(qū)域神經軸突再生，使受損靶器官(骨、軟組織等)接受神經再支配，調控這些組織損傷后的修復再生過程[14]。而新血管形成是所有組織損傷后修復、組織工程再血管化以及再生醫(yī)學的必要步驟。所有組織損傷時，血管內皮細胞都會誘發(fā)血小板的聚集與活化，啟動后續(xù)一系列生物學活動。濃縮血小板通過釋放各種促血管形成的生長因子(PDGF、VEGF、bFGF等)和細胞因子(IL-8、IL-3、αvβ3-integrin 212等)，以及基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)，相互協(xié)調完成新血管形成。機制包括：促使血管基膜降解，內皮細胞增殖和遷移，血管腔形成，基膜重排以及外周或血管平滑肌細胞募集，周細胞的增殖、遷移，血管壁成熟。構成新血管形成所需的微環(huán)境，募集和調控間充質干細胞。在組織工程材料方面，濃縮的血小板具有促間充質干細胞增殖但不引起分化的優(yōu)勢[15]。

以上資料顯示，在組織損傷修復中，濃縮血小板發(fā)揮作用的機制可能包括：殺菌、調節(jié)炎癥細胞，啟動免疫反應；調控修復(干)細胞的增殖、分化和遷移，以及凋亡過程；維持毛細血管上皮細胞完整性、有助于新血管形成；調控干細胞再生微環(huán)境、改變組織修復信號蛋白的濃度，影響信號通路轉導。因此，適用于所有創(chuàng)傷外科領域，如矯形外科、運動醫(yī)學、神經外科、心胸外科、泌尿外科、口腔頜面外科、耳鼻喉、眼科、整形美容外科[16]，尤其是當前熱門的組織工程和再生醫(yī)學。

3 濃縮血小板產品的標準化問題

濃縮血小板產品表現(xiàn)出的越來越多生理功能，在各創(chuàng)傷領域也表現(xiàn)出一大批可喜的治療結果。但有部分臨床試驗顯示，運用濃縮血小板產品修復組織缺損的作用并不顯著。既然血小板是一種分泌型細胞，那么其應用屬于生物細胞治療的一部分，這就存在所有細胞治療所面臨的共同問題，即標準化。每一次濃縮血小板產品的制備條件都會影響血小板的活化與功能[17]。可能的原因包括：所有血小板濃縮產品中活性物質(包括生長因子、黏附分子、趨化因子等)含量的多少取決于其在血小板活化時的釋放情況。涉及研究人員及臨床工作者制備標準(離心速度、時間)、提取、純化技術的差異，以及所導致不同的血小板濃度比和血小板活化及碎裂程度的客觀因素(溫度、耗材等)。另外，特殊人群(年齡、貧血、代謝性疾病等)、服用藥物(阿司匹林等)情況對血小板功能本身有影響，其濃縮后的生物學效用差別極大[18]，如濃縮血小板激活產生大量的纖維蛋白支架的硬度與血小板數(shù)量非線性關系，且對間充質干細胞的生物學行為產生不同的影響。

即使限定血小板在血漿中的相對數(shù)量，也會由于生理周期的變化、制備條件導致濃縮血小板所含活性物質的差異。另外，白細胞所占比例、血小板活化時釋放的細胞外囊泡(extracellular vesicleis,EV)情況、各類生長因子含量的構成比，以及其他很多活性成分(如thrombin)都影響著最終參與修復時啟動信號通路和活化蛋白的差異。各類修復細胞對不同濃度和質量血小板的反應并不相同。選擇性激活濃縮血小板達到對修復組織的要求，即構建合理的微環(huán)境十分必要。更為關鍵的是，目前并不知道EPT完整作用的分子機制。對于濃縮血小板注射應用時可能會導致局部組織的炎癥，如何減少或合理控制尚待進一步探討。因此，致力于濃縮血小板研究的學者們應盡早制定一份關于EPT臨床使用的專家共識或指南，規(guī)范濃縮血小板產品的制備、儲存與轉運，不同組織使用和治療時的質控標準，并不斷在深入研究中完善。國際和國內相關機構當前應加快進行一些關鍵質控指標的指導與限定，但由于涉及領域多，既是優(yōu)勢也是弊病，同一材料不可能滿足不同組織修復的需求。這將是今后一個時期，這項治療手段面臨的重要問題之一。

4 展望

創(chuàng)傷外科應用濃縮血小板產品的優(yōu)勢有：(1)自源性，避免外源性生長因子的免疫排斥和疾病傳染風險；(2)制備簡便、快捷、方法成熟，目前市場上有多種儀器和套裝；(3)含多種高濃度生長因子協(xié)同作用，彌補單一因子不足；(4)根據(jù)促生長、充填、支架需要，可選擇不同的濃縮血小板形式；(5)制備對患者損傷小，只需從周圍取血即可；(6)具有抗菌能力，多種成分發(fā)揮抗菌活性；(7)能夠對包括血管神經在內的多種組織同步修復，符合機體的生理需求。特別是近年提出在損傷組織的再生醫(yī)學應用，避免生物合成多肽應用中安全性的顧慮。對于當前創(chuàng)傷外科越來越多地使用生物材料(關節(jié)、骨水泥、殼聚糖、鈦網、硅膠等)，加用濃縮血小板在防止植入物發(fā)生細菌生物膜、引發(fā)感染，減少手術失敗方面是有益的[19]。

濃縮血小板在體內還是體外激活對修復細胞的生物學行為影響很大，如近年來外泌體(exosome)的研究如火如荼。已有研究表明，血小板活化后所分泌的細胞外囊泡能釋放兩種微粒，一種是直徑>100nm的多囊泡體(MVBs)和α顆粒，另外一種則是由多囊泡體和α顆粒進一步激活后釋放的直徑40～100nm外泌體，這些細胞外囊泡對釋放生長因子、炎癥因子、黏附蛋白、信號通路蛋白、micrRNA等成分的構成比對濃縮血小板的功能產生巨大影響，進而對細胞遷移和增殖、加速血管新生、調控細胞凋亡和存活，以及細胞間信號交互發(fā)生改變，顯示出組織修復和再生過程中各自獨特的生物學作用[20]。隨著外泌體在再生醫(yī)學的研究逐漸深入，將外泌體某些指標作為濃縮血小板細胞治療的指標，或許是解決細胞移植標準，使之科學、合理應用于再生修復領域的重要途徑。另外新近研究表明，濃縮血小板影響周圍血單核細胞和樹枝狀細胞的分化，其免疫調控反應對再生微環(huán)境的影響在組織損傷后的修復過程中不可忽視，甚至對修復結局的影響舉足輕重[21-22]。血小板的抗炎和抗菌肽[23]作用可能對當前研究熱點——“微生物區(qū)(microbiota)”產生影響，微生物區(qū)可以干預修復進程[24-25]。新的激活方式(如超聲波、脈沖電場等)是否會提高濃縮血小板的活性產物釋放，滿足不同層及組織修復的需要，達到理想的治療效果值得探索[26]。而與新型生物材料聯(lián)合使用可能對濃縮血小板在創(chuàng)傷修復更廣闊范圍使用中有巨大的推動作用[27]。

總之，劑量(不同的修復組織或細胞)、時間(受損時間)、形式(是否激活、是否混合炎癥細胞、注射或外用)，以及在構建組織工程進行創(chuàng)傷修復與再生時所需的最佳微環(huán)境濃度均是未來要關注的重點。在提倡精準醫(yī)學(治療)的今天，如何為創(chuàng)傷組織定制一個有益的濃縮血小板產品還需要進行大量的基礎研究和臨床驗證。