(河北省滄州水文水資源勘測局,河北 滄州 061000)

葉綠素a含量是評價湖泊富營養(yǎng)化程度的重要參數之一。因此，探討其檢測分析方法的實用性具有重要的現實意義。本文對研磨法與反復凍融法測定大浪淀水庫中葉綠素a的含量進行了比對分析，結果表明：反復凍融法是最佳的分析方法。

1 實 驗

1.1 水樣采集

水樣來自河北省滄州市大浪淀水庫。大浪淀水庫于1997年建成，是河北省第一座平原水庫，屬大(2)型，總投資2.8億元，蓄水面積16.738km2，設計總庫容1.003億m3，每年可向市區(qū)供水8121萬m3，是滄州市居民用水的主要水源地。

1.2 主要試劑

90%丙酮溶液、1%碳酸鎂懸濁液。

1.3 儀器和設備

可見分光光度計、低溫冰箱、離心機、抽濾裝置、研缽、微孔濾膜、培養(yǎng)皿、具塞玻璃離心管。

1.4 實驗方法

將一定量水樣用玻璃纖維膜過濾，收集藻類，分別使用研磨法和反復凍融法對藻類細胞進行破碎，用90%的丙酮溶液提取葉綠素，根據葉綠素光譜特征依次測定750nm、664nm、 647nm、 630nm波長下的吸光度，計算葉綠素a的含量。

1.5 實驗目的

此次操作設計了兩組實驗。一組實驗是由同一檢測人員分析同一樣品的多個平行樣，且樣品的取樣體積均相等,檢驗研磨法和反復凍融法的重現性，結果見表1。另一組實驗是由不同的檢測人員用不同的提取方法測定葉綠素a，檢驗不同檢測人員分析結果的精密度，結果見表2。

表1 研磨法和反復凍融法比對測定結果 單位：μg/L

2 實驗分析與討論

2.1 兩種方法對比試驗

兩種方法結果比對分析，表明兩種提取方法有顯著性差異，反復凍融法的方差明顯低于研磨法。由標準偏差可以看出，反復凍融法和研磨法的平行樣品之間差異顯著性不大，反復凍融法實驗的重現性高于研磨法，反復凍融法避免了研磨法因多次轉移樣品帶來的操作誤差。

表2 不同檢測人員研磨法和反復凍融法測定結果比對 單位：μg/L

由表2可以看出，研磨法測定樣品的均值和標準偏差相差較大，而反復凍融法測定樣品的均值和標準偏差相差不大。這說明對于不同的檢測人員利用研磨法測定樣品，測定結果差異較大；而不同的檢測人員利用反復凍融法測定樣品，測定結果無顯著性差異。實驗證明：采用反復凍融法，只要檢測人員按照實驗要求去做，就不會因為檢測人員不同而影響測定結果，而利用研磨法，檢測人員研磨時的力度、方法、轉移樣品是否完全都會影響測定結果。因此，反復凍融法的實驗結果沒有因為檢測人員的更換而出現大幅度的波動，精確度高。兩種方法結果比對分析，表明:兩種提取方法有顯著性差異，反復凍融法的方差明顯低于研磨法。由標準偏差可以看出，反復凍融法和研磨法的平行樣品之間差異顯著性不大，反復凍融法實驗的重現性高于研磨法，反復凍融法避免了研磨法因多次轉移樣品帶來的操作誤差。

2.2 破碎液的顯微觀察

葉綠素a含量的測定，關鍵環(huán)節(jié)在于能否將葉綠素從細胞中有效提取出來，多次冷熱交替的反復凍融法，提高了細胞的破碎率。在觀察細胞破碎的實驗中，為了便于觀察和計數，采用了實驗室培養(yǎng)的柵藻，稀釋到一定濃度，進行凍融和研磨，在顯微鏡下觀察破碎情況，計算破碎率，結果表明反復凍融法的破碎率在90%以上，而研磨法的破碎率僅為50%～60%。

3 實驗注意事項

實驗過程中，使用的玻璃器皿和比色皿均應清潔、干燥，但不要用酸浸泡和洗滌。分析時均使用符合國家標準的A級玻璃量器，分析純試劑和純水。整個實驗操作應在暗處進行，因為葉綠素提取液對光非常敏感，極易發(fā)生光和作用。有關實驗數據表明：樣品置于暗處，24h內基本不分解，弱光條件下，1h內基本不分解，光照條件下會很快分解，因此，提取后的樣品應盡快測定，提取操作等應在低溫、暗處進行。

4 試驗結果分析與討論

a.根據實驗比對，反復凍融法的相對偏差遠遠小于研磨法的相對偏差，說明反復凍融法的實驗結果沒有出現大幅波動，精確度高，同時在實驗中發(fā)現只要掌握好凍融的時間和室溫，細胞的破碎程度也不會因為檢測人員的不同而有明顯變化。而研磨法的細胞破碎程度與檢測人員有很大關系，由于檢測人員研磨時的力度、方法均有差異，因而，使用研磨法，檢測人員不同，細胞的破碎程度會有明顯差異。同時隨著研磨時間延長，樣品暴露在自然陽光下的時間增加，葉綠素的破壞程度會有所加大。

b.反復凍融和研磨兩種方法在測定所需的時間上無明顯差異，但是反復凍融法減少了檢測人員接觸丙酮的時間和次數，保護了檢測人員的身體健康，同時反復凍融法所需要的儀器少，故適合大批量的樣品分析。

c.反復凍融法操作簡單，減少了樣品的轉移次數，降低了樣品的損失，同時提高了細胞的破碎率，避免了研磨不完全而帶來的人為誤差，提高了實驗的準確度和精確性。

d.在處理大批量的樣品時，反復凍融法所需的實驗器材遠遠低于研磨法，大大提高了工作效率。

e.對葉綠素a測定值的評價。結果表明：用反復凍融法處理水樣具有安全、高效的特性,750nm 處吸光度值容易達到0.005。

5 結 語

反復凍融法所需儀器設備少，操作簡便，減少污染，準確度高，適用于大批量樣品檢測，因此反復凍融法測定葉綠素a具有一定的實用價值。

[1] 趙辛.葉綠素a方法改進的探討[J].福建分析測試,2007(16):31-32.

[2] 林少君.浮游植物中葉綠素a提取方法的比較與改進[J].生態(tài)科學,2005(1)：9-11.

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