■崔艷紅 韓慶功 王九峰 魏剛才 劉長忠

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，北京100193；2.河南科技學(xué)院動物科技學(xué)院，河南新鄉(xiāng)453003）

益生菌是能促進(jìn)動物胃腸內(nèi)（主要是腸道）菌群生態(tài)平衡的活性微生物，因其無毒、無殘留、多功能、不污染環(huán)境等特點(diǎn)而日益受到青睞，是可作為抗生素替代品的一種新型環(huán)保飼料添加物。植物乳桿菌(Lactobacillus pluuturum，LP)是乳酸菌中的一種，屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬，革蘭氏陽性、無芽孢、厭氧或兼性厭氧菌，最適生長溫度為30～35℃[1-2]，菌種為桿狀，呈單個、有時成對或成鏈狀排列，最適pH值6.5左右，屬于同型發(fā)酵乳酸菌[3]。

1989年美國食品藥物管理局(FDA)和美國飼料認(rèn)定協(xié)會(AAFCO)將植物乳桿菌列入可直接飼喂的益生菌菌種目錄。我國農(nóng)業(yè)部自1999年第105號公告起，到2013年第2045號公告《飼料添加劑品種目錄》，每次修訂后的目錄都將植物乳桿菌作為動物養(yǎng)殖的微生物添加劑之一。目前用作益生菌的乳酸菌主要來源于人和動物的腸道或糞便，當(dāng)前乳酸菌被廣泛應(yīng)用在食品、飼料發(fā)酵和微生態(tài)制劑領(lǐng)域。作為人和動物腸道重要的益生菌群，在代謝過程中，乳酸菌能通過競爭性抑制作用在胃腸道內(nèi)占位、定植，抑制致病菌對胃腸道侵害，改善腸道微生物多樣性，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，提高機(jī)體免疫力和促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)吸收等多種作用[4-11]。通常將乳酸菌的耐酸、耐膽鹽和黏附定植能力等作為評價篩選潛在益生菌的重要標(biāo)準(zhǔn)。現(xiàn)就植物乳桿菌對胃腸道環(huán)境的適應(yīng)能力、黏附特性、對胃腸道微生態(tài)的調(diào)節(jié)和腸黏膜形態(tài)的影響等方面進(jìn)行綜述。

1 植物乳桿菌對仔豬胃腸道環(huán)境的耐受力

植物乳桿菌對動物高胃酸環(huán)境和消化道內(nèi)膽鹽等形成的高滲環(huán)境的耐受力是評價其益生效果好壞的重要指標(biāo)。對胃內(nèi)pH值、腸道膽鹽等的耐受性是保證益生菌在宿主體內(nèi)存活和生長的前提，是其發(fā)揮益生作用的先決條件。新生仔豬胃內(nèi)pH值通常在5.0～6.0之間，仔豬在斷奶后1～2周pH值恢復(fù)到3.5左右[12]，但依然高于成年豬pH值2.0～3.5的水平，飼料在胃內(nèi)的停留時間一般為2～4 h。腸道中膽鹽的濃度一般在0.03%～0.3%的范圍內(nèi)[13]。

張飛燕等[14]從健康散養(yǎng)雞的雞糞便中分離得到的植物乳桿菌，在pH值2.0的條件下，存活率可達(dá)到86%以上，在膽鹽濃度為0.3%時，存活率有所下降，為53.7%，但繼續(xù)提高膽鹽濃度到0.4%時，存活率仍可保持在36%以上。許女等[15]從西藏Kefir粒中分離獲得植物乳桿菌MA2，菌株在培養(yǎng)基pH值為2的酸性環(huán)境中培養(yǎng)2 h后，活菌數(shù)下降了兩個數(shù)量級，從108下降到106；在培養(yǎng)基中膽鹽濃度為0.3%時，活菌數(shù)也下降了兩個數(shù)量級，但當(dāng)膽鹽濃度提高到0.5%時，活菌數(shù)下降到105，只降低了3個數(shù)量級，表明植物乳桿菌MA2菌株具有良好的耐酸、耐膽鹽特性。隋夢等[16]從發(fā)酵米粉中篩選出的植物乳桿菌Zhang-LL，菌株在pH值1.5～3.0的酸性環(huán)境中培養(yǎng)3 h，活菌數(shù)只下降了一個數(shù)量級，菌液濃度可達(dá)106CFU/ml；在膽鹽濃度為0.10%～0.50%環(huán)境中培養(yǎng)8 h后，活菌數(shù)在105～107CFU/ml之間，表明獲得的分離株具有較強(qiáng)的耐受胃腸道酸性和高滲環(huán)境的特性。在模擬人工胃液和腸液環(huán)境條件的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌N59-1在pH值為3的人工胃液中培養(yǎng)3 h后，存活率仍可達(dá)到為89%以上，再從胃液轉(zhuǎn)移到腸液保持3 h后，N59-1的存活率仍大于80%[17]。

張艷萍等[18]以海藻酸鈉和脫脂乳作為混合壁材對植物乳桿菌A409微囊化，微囊化后對酸性條件、膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)、人工胃液和人工腸液均有較高的耐受性，穩(wěn)定性良好。程福亮等[19]的研究表明，豬源植物乳桿菌誘變株BL-15耐酸性較好，其在酸性條件下存活菌落總數(shù)的對數(shù)值與對照組基本一致；在耐膽鹽試驗(yàn)中，存活菌落總數(shù)與對照組中菌落總數(shù)的對數(shù)值相差小于2，表明對酸和膽鹽耐受效果較好。孟祥晨等[20]的研究表明，兩株植物乳桿菌在pH值3的PBS緩沖溶液中保持3 h，活菌數(shù)均超過9 log CFU/ml，在0.3%的膽鹽濃度中孵育8 h和在1%的膽鹽濃度中孵育4 h后，兩株植物乳桿菌活菌數(shù)均維持在8 log CFU/ml，表明對低酸和高膽鹽有較好的耐受力。不同來源的植物乳桿菌可以抵抗胃液較強(qiáng)的酸性環(huán)境和耐受動物消化道內(nèi)膽鹽等形成的高滲環(huán)境，順利地到達(dá)仔豬腸道并存活，從而為發(fā)揮其益生功能奠定了基礎(chǔ)。

2 植物乳桿菌的黏附及對致病菌的黏附抑制

黏附是益生菌定植于宿主腸道發(fā)揮生理作用的前提條件，是實(shí)現(xiàn)其益生功能的第一步[21-22]。通過競爭性占位，在宿主腸黏膜形成生物屏障，從而排斥或置換阻止病原菌的定植；黏附定植腸道的乳酸菌，在適宜的環(huán)境中迅速生長繁殖，同時產(chǎn)生大量的初級代謝或次級代謝產(chǎn)物（如有機(jī)酸、過氧化氫和細(xì)菌素等），這些產(chǎn)物有利于調(diào)節(jié)胃腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的平衡的和激發(fā)宿主胃腸道免疫系統(tǒng)的發(fā)育[22-23]。有研究表明，乳桿菌的黏附具有較強(qiáng)的種屬特異性和宿主特異性[22-23]。在體外評價和篩選益生菌時，其黏附定植能力是衡量益生菌活菌制劑效果的重要指標(biāo)之一。

凌晨等[24]報道，乳酸菌可以黏附于仔豬腸上皮細(xì)胞且表現(xiàn)出劑量效應(yīng)。乳酸菌與沙門菌或大腸埃希菌的黏附競爭，與對照組相比，致病菌的黏附能力受到抑制，并且對致病菌的黏附抑制率也呈現(xiàn)出劑量效應(yīng)，高含量的乳酸菌對沙門菌、大腸埃希菌的排斥率均高達(dá)88%以上，置換率也均達(dá)到70%以上。但是，低含量的乳酸菌黏附排斥作用顯著下降，同時自身黏附細(xì)胞的能力也顯著下降，對沙門菌的置換在低劑量時效果較差，甚至出現(xiàn)負(fù)向效果，即不但沒有發(fā)揮置換作用，反而增加了沙門菌對細(xì)胞的黏附率。張莉[25]在研究中發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌C88對氯仿的疏水性極強(qiáng)（＞80%），氯仿為單極、酸性溶劑，是電子受體，表明C88菌株是強(qiáng)電子供體，對二甲苯和乙酸乙酯也都有較強(qiáng)的疏水性，從而間接表明C88菌株可能具有較強(qiáng)的黏附腸上皮細(xì)胞的能力。乳酸菌對Caco-2細(xì)胞的黏附試驗(yàn)表明，菌株C88對Caco-2單層細(xì)胞的黏附率高于鼠李糖乳桿菌GG；在黏附競爭試驗(yàn)中，菌株C88對四種致病菌（大腸桿菌、葡萄球菌、沙門氏菌和福氏志賀氏菌）抑制率為22%～71%不等，對四種致病菌的排斥作用和置換作用也很強(qiáng)，除排斥試驗(yàn)中的沙門氏菌外，其他都達(dá)到了極顯著的水平。有研究發(fā)現(xiàn)L.plantarumCS24.2能夠抑制30%～90%腸致病性大腸桿菌（EPEC）和腸炎沙門氏菌血清型傷寒沙門氏菌在人體腸上皮細(xì)胞Caco-2的定植，Dhanani等[26-27]的研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌黏附素EF-Tu在黏附腸道組織和抑制腸道病原體中發(fā)揮重要作用。Dhanani等[28]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌CS24.2能抑制大腸桿菌O26∶H11對HT-29細(xì)胞的黏附，在大腸桿菌感染HT-29細(xì)胞后，并下調(diào)了細(xì)胞中TNF-α和IL-8的基因表達(dá)。Ren等[29]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌能強(qiáng)烈抑制金黃色葡萄球菌對Caco-2細(xì)胞的黏附作用。

很多因素會影響乳酸菌黏附腸道上皮細(xì)胞，細(xì)菌自身因素如細(xì)菌生長時期、菌液濃度、乳酸菌細(xì)胞壁表面存在的壁磷壁酸、脂磷壁酸、肽聚糖、S層蛋白、相關(guān)表面蛋白和細(xì)胞分泌的胞外多糖等黏附素[30]；動物因素如腸道內(nèi)pH值、溫度和腸道黏液的組分等。研究表明，乳酸菌的黏附定植具有屬種特異性和劑量效應(yīng)，對病原菌的抑制效果也與劑量、代謝產(chǎn)物等因素有關(guān)，動物黏附效應(yīng)已經(jīng)被多數(shù)試驗(yàn)證明是益生菌抵抗致病菌的重要影響因子[31]，但具體的分子作用機(jī)制還不是很清楚。目前用于乳酸菌黏附特性評價的體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭饕屑?xì)胞模型、腸黏液模型和組織器官模型三類，但這些模型各具優(yōu)劣，能真實(shí)反映乳酸菌在宿主腸道黏附效果，統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)的乳酸菌黏附機(jī)制評價模型尚未建立。另也有不同的報道，如有人給17名健康志愿者每天兩次，連續(xù)服用18 d含6×109CFU的益生菌凍干粉A(L.plantarumMF1291，MF1298)和B(L.pentosusMF1300，L.salivariuDC5，L.plantarum DC13)，結(jié)果從糞便中不能監(jiān)測到L.plantarumDC13,在清除期的第24 d和30 d，從糞便中也不能監(jiān)測到L.plantarumMF1291和L.salivariuDC5[32]。因此益生菌在腸道中的黏附和定植是否是益生菌發(fā)揮生物活性的必須要素還需要進(jìn)一步的證實(shí)。

3 乳酸菌對腸道微生物多樣性的影響

在健康仔豬胃腸道微生物群落結(jié)構(gòu)中，絕大多數(shù)的乳酸菌菌種對仔豬的健康是有益的，并且乳酸菌屬厚壁菌門，是腸道最占優(yōu)勢的菌群之一；相反，腸桿菌科中很多菌種對動物是有害的，腸桿菌屬變形菌門，一般是致病菌或者條件致病菌。因此，創(chuàng)造有利乳酸菌生長繁殖的條件，提高乳酸菌在腸道菌群中的豐度，減少致病菌的數(shù)量是保證仔豬腸道健康的關(guān)鍵。

益生菌可以提高腸道菌群的多樣性，抑制致病菌的生長繁殖，從而實(shí)現(xiàn)維持腸道微生物群落的動態(tài)平衡[33]。已有研究表明，乳酸菌能選擇性促進(jìn)有益菌群的繁殖，提高腸道有益優(yōu)勢菌群所占比例，抑制有害微生物的生長，從而有效調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，Guerra-Ordaz等[4]報道，對斷奶仔豬飼喂植物乳桿菌[2×1010CFU/(頭·d)]8 d后，進(jìn)行ETEC K88攻毒試驗(yàn)，在攻毒后第6 d和第10 d屠宰，評價植物乳桿菌控制斷奶后仔豬大腸桿菌病的潛力，結(jié)果表明益生菌組顯著增加了植物乳桿菌在回腸和結(jié)腸中的數(shù)量，在結(jié)腸中的總?cè)樗峋鷶?shù)量也顯著增加，并顯示出減少腹瀉的趨勢。飼喂植物桿菌發(fā)酵飼料有益于豬抗沙門氏菌感染，影響或減少豬糞中腸桿菌科的數(shù)量[8-9]。趙秀英等[10]研究報道，斷奶前給仔豬飼喂植物乳桿菌和干酪乳桿菌，植物乳桿菌可顯著提高斷奶前回腸、結(jié)腸菌群多樣性和提高腸道乳酸菌和雙歧桿菌的數(shù)量。與斷奶前相比，斷奶后3 d三組菌群多樣性都有所下降，表明腸道菌群的多樣性易受斷奶應(yīng)激的影響，但植物乳桿菌組的菌群多樣性依然顯著高于其他組，表明植物乳桿菌能緩解斷奶對菌群造成的影響，到斷奶后2周時，植物乳桿菌組菌群多樣性顯著高于對照組，并可促進(jìn)回腸、結(jié)腸乳酸菌和雙歧桿菌的生長。Tajima等[6]報道，用植物乳桿菌發(fā)酵液體飼料喂仔豬，與對照組和抗生素組相比，可以提高仔豬回腸和盲腸中細(xì)菌的多樣性，但三個處理組回腸中的大部分細(xì)菌序列屬于乳酸菌，占總細(xì)菌序列的92%以上。在盲腸中，對照組和抗生素組仍是乳酸菌占主導(dǎo)地位，分別占59%和64%。但在液體發(fā)酵飼料組中乳酸菌占總細(xì)菌序列的比例下降至31%，但厚壁菌門中的Dorea屬、糞球菌屬、羅斯氏菌屬和柔嫩梭菌豐度增加，胃腸道中的細(xì)菌多樣性增強(qiáng)。Kobashi等[7]報道，飼喂植物乳桿菌發(fā)酵液體飼料，仔豬糞便中乳酸菌的數(shù)量由斷奶時的8.77×108CFU/g DM，在斷奶后第28天增加至1.23×1012CFU/g DM，表明飼喂發(fā)酵液體飼料可以增加腸道內(nèi)乳酸菌的數(shù)量。幾乎分離獲得的大腸桿菌菌株在斷奶后14 d內(nèi)全部耐金霉素，在斷奶后第28 d，發(fā)酵液體飼料組的耐金霉素的大腸桿菌菌株降低至22.2%，而對照組中的耐藥菌比例為88.9%，顯示飼喂發(fā)酵液體飼料會減少抗生素抗性細(xì)菌。

De Angelis等[34]報道，乳酸菌黏附和定植在腸道后，成為腸道正常菌群的成員，能夠阻止腸道細(xì)菌移位和調(diào)節(jié)微生態(tài)平衡。Fuentes等[35]報道，口服活的植物乳桿菌或者復(fù)合益生菌制劑有效地抑制斷奶仔豬腸道大腸桿菌數(shù)量，增加腸道有益菌如乳酸菌、雙歧桿菌的多樣性和數(shù)量，調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。

4 乳酸菌對腸道組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

單胃動物蛋白質(zhì)的60%～70%是在小腸消化，因此小腸通常被認(rèn)為是仔豬營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的主要場所，通過營養(yǎng)調(diào)控手段，促進(jìn)腸絨毛的發(fā)育和改善微絨毛結(jié)構(gòu)，可以增加小腸內(nèi)壁表面積，從而提高對營養(yǎng)素的吸收效率。絨毛之間的隱窩是絨毛新細(xì)胞的來源，當(dāng)絨毛損傷脫落時，隱窩細(xì)胞會向絨毛頂移行，并形成新的腸絨毛，隱窩深度是衡量腸上皮細(xì)胞更新速度的指標(biāo)，隨著細(xì)胞成熟率的上升，隱窩逐漸變淺，并且細(xì)胞的分泌功能增強(qiáng)。絨毛高度與隱窩深度比值能綜合反映小腸的功能狀態(tài)，當(dāng)腸黏膜受損時，則比值下降，表明動物的消化吸收功能下降[36-37]。

腸道是重要的營養(yǎng)吸收器官，腸絨毛高度、隱窩深度等都是衡量小腸消化吸收功能的重要指標(biāo)。Gao等[37]的研究表明絨毛高度/隱窩深度能夠綜合反映小腸的功能狀態(tài)，其比值的下降，表明黏膜受損、消化吸收功能下降。劉虎傳等[38]研究結(jié)果表明，給斷奶仔豬飼喂乳酸菌后，可顯著提高28、35 d和42 d仔豬空腸和回腸絨毛的高度，顯著降低35、42 d仔豬空腸和28、35 d回腸的隱窩深度，顯著增加盲腸內(nèi)容物中短鏈脂肪酸的含量，緩解了斷奶應(yīng)激對仔豬腸道內(nèi)環(huán)境的影響。Guerra-Ordaz等[4]報道，斷奶仔豬飼喂植物乳桿菌10 d后（2×1010CFU/d），回腸絨毛高度和杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，結(jié)腸消化道中氨的濃度降低，腸道內(nèi)環(huán)境得到改善。Suo等[5]研究表明，斷奶仔豬飼喂植物乳桿菌ZJ316 60 d后，提高了斷奶仔豬十二指腸、空腸以及回腸的絨毛高度，明顯促進(jìn)了小腸絨毛的發(fā)育，從而有利于提高對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，進(jìn)而促進(jìn)仔豬日增重和飼料轉(zhuǎn)化率的提高。

縣怡涵等[11]報道，仔豬從7日齡開始至24日齡隔日灌喂植物乳桿菌菌液，結(jié)果表明，能促進(jìn)35日齡斷奶仔豬空腸和回腸絨毛發(fā)育，增加了空腸絨毛的高度，顯著提高回腸隱窩深度，有增加回腸絨毛高度，降低絨腺比的趨勢。使用植物乳桿菌，能明顯改善腸道黏膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)，促進(jìn)腸上皮細(xì)胞的生長，增加絨毛長度/隱窩深度。另外，植物乳桿菌NCU116能促進(jìn)腸上皮細(xì)胞中杯狀細(xì)胞的增殖，并且提高黏蛋白的分泌量，增加腸道黏膜的完整性，有效增強(qiáng)了腸道上皮的屏障防御能力[39]。

5 小結(jié)

植物乳桿菌是動物腸道正常的有益菌群之一，是生產(chǎn)實(shí)踐中選擇制備益生菌制劑的常用菌種，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、抑制有害菌定植、增強(qiáng)腸黏膜免疫等作用，但其作用效果受菌株屬種特異性、菌株劑量效應(yīng)、動物個體生理差異等諸多因素影響，常導(dǎo)致研究應(yīng)用中效果不確實(shí)。目前就乳酸菌的研究，主要集中在乳酸菌的益生功能和其代謝產(chǎn)物方面，但關(guān)于代謝產(chǎn)物對宿主的作用模式、如何調(diào)控宿主的基因表達(dá)及維持微生物區(qū)系穩(wěn)定的分子機(jī)制等的研究還較少。益生菌的益生效應(yīng)不僅是在腸道的黏附定植和對致病菌抑制，更重要的是如何改變腸道菌群的組成，使之與有害菌爭奪營養(yǎng)物質(zhì)，從而抑制致病菌的生長和對宿主形成免疫應(yīng)答刺激。在今后的研究中，應(yīng)在細(xì)胞和分子水平上探討就菌株發(fā)揮作用的有效成分、養(yǎng)分吸收轉(zhuǎn)運(yùn)、黏附抑制和刺激腸黏膜免疫的機(jī)制。

腸道微生態(tài)的平衡是一個復(fù)雜的過程，涉及到宿主和微生物間及微生物和微生物間復(fù)雜的調(diào)控反應(yīng)，飼料營養(yǎng)水平、消化道內(nèi)環(huán)境、宿主免疫系統(tǒng)、抗生素的使用和仔豬哺乳斷奶情況等宿主因素均會影響腸道微生物組成與分布。利用分子生物學(xué)手段，不斷深入探討腸道生態(tài)系統(tǒng)和宿主間的關(guān)系，通過膳食纖維、短鏈脂肪酸、菌群代謝產(chǎn)物等營養(yǎng)手段調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)節(jié)影響宿主代謝狀態(tài)，配合微生物基因組技術(shù)闡明微生物菌群關(guān)鍵成員發(fā)揮作用的分子機(jī)制，證明腸道菌群的改變與發(fā)生炎癥性疾病、肝病、肥胖和腸癌等腸道疾病之間的關(guān)系，將為促進(jìn)動物機(jī)體健康、預(yù)防和治療疾病提供理論基礎(chǔ)，隨著對乳酸菌研究的不斷深入，將會出現(xiàn)更多的功能性添加劑產(chǎn)品，并在未來的應(yīng)用中發(fā)揮重要的作用。