高 鋒，張曉峰，段艷偉，嚴(yán)懷寧，潘永飛，葉 榮

脊髓損傷對(duì)于當(dāng)前臨床治療來(lái)說(shuō)是個(gè)難點(diǎn)，在既往的臨床治療過(guò)程中，特別是所謂“金標(biāo)準(zhǔn)”的自體神經(jīng)移植，往往會(huì)帶來(lái)諸如供體神經(jīng)缺少、供區(qū)部位損傷及修復(fù)效果不理想等并發(fā)癥[1]。隨著組織工程研究的進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)了諸如聚羥基丁酸(polyglycolic acid, PGA)，聚左旋丙交酯(poly(L-lactic acid), PLLA)等這類高分子材料不僅可以模擬細(xì)胞外基質(zhì)，還可以為細(xì)胞的黏附和生長(zhǎng)提供良好的環(huán)境[2]。在既往的研究中發(fā)現(xiàn)，PLLA在體外可促進(jìn)干細(xì)胞的增殖分化，體外對(duì)脊髓損傷亦有一定的修復(fù)作用。在本研究中，筆者制備了PLLA支架，進(jìn)一步研究了其體外對(duì)細(xì)胞的作用及體內(nèi)脊髓損傷修復(fù)的作用。

1 材料與方法

1.1 PLLA納米纖維膜制備 制備PLLA纖維的溶液配制如下：PLLA和PEO以質(zhì)量比9∶1混合溶于TFE中，終濃度為2 wt %。將制備好的靜電紡絲溶液置于注射器中，注射器一端連接6#不銹鋼針頭(內(nèi)徑為0.5 mm)，另一端與注射泵相連，泵的推進(jìn)速度為5 ml/h。鋁箔作為納米纖維的接收端，在針頭和收集端的距離為20 cm，并施加12 kV的高壓直流電，其中針頭接正極，收集端接負(fù)極。制備的所有纖維都放入真空干燥箱中60 ℃ 24 h去除有機(jī)溶劑殘留[3]。

1.2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取 取SD大鼠1只(出生4周左右，雌雄不限，體重150 g左右，江蘇省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心)，以2%戊二醛腹腔注射麻醉后，75%乙醇浸泡3 min后，從大鼠股骨下端抽取骨髓，將骨髓與含10%FBS的MEM全培養(yǎng)液以1∶8的體積比例混勻，接種于50 ml培養(yǎng)瓶，于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(5%CO2、37 ℃)培養(yǎng)，2 d后首次換液，以后每3～4 d換1次液。待培養(yǎng)至第12～14 d，細(xì)胞覆蓋瓶底面積80%左右，用0.1%胰蛋白酶和0.02%的EDTA于標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下消化5 min，按照1∶3的比例傳代培養(yǎng)，以后待細(xì)胞基本長(zhǎng)滿，按上述方法消化傳代，從而純化并擴(kuò)增BMSCs[4]。

1.3 干細(xì)胞培養(yǎng)及活性檢測(cè) 將制備得到的PLLA納米纖維支架材料切割為圓形，直徑略小于48孔板的孔徑，以75%乙醇消毒5 min，然后用0.01 mol/L的PBS洗3遍。將P3 BMSCs(Bone mesenchymal stem cells)制備成5×106/ml的細(xì)胞懸液，接種PLLA納米纖維膜上，利用虹吸原理使BMSCs均勻分布。在培養(yǎng)1、4、7 d后，用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8(Dojindo，日本)進(jìn)行檢測(cè)，CCK-8溶液以1∶10稀釋于α-MEM培養(yǎng)液中混勻，每個(gè)樣品加入220 μl稀釋液后于5% CO2培養(yǎng)箱中37 ℃孵育3 h，然后每孔取100 μl液體轉(zhuǎn)移到96孔板中，在微孔板讀板儀(Symergy HT，Bio-tek，美國(guó))上讀取450 nm波長(zhǎng)處吸光值。樣品中剩余含CCK-8的培養(yǎng)液棄去，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，可連續(xù)測(cè)數(shù)天的吸光值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次每樣品設(shè)置6個(gè)重復(fù)。對(duì)照組為未在纖維膜上培養(yǎng)的干細(xì)胞。

1.4 干細(xì)胞向神經(jīng)方向的分化檢測(cè) 接種細(xì)胞1 d，待細(xì)胞與材料融合后，將樣品從培養(yǎng)箱中取出，吸除培養(yǎng)液，每孔中加入200 μl事先配制好的RA誘導(dǎo)液(碧云天，中國(guó))，乙醇擦拭，放入培養(yǎng)箱中。24 h后在倒置顯微鏡下觀察對(duì)照組細(xì)胞形態(tài)變化，每隔3 d換1次液。于加入RA誘導(dǎo)液后第3、6天，從實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組進(jìn)行Nestin、MAP-2抗體(Sigma公司，美國(guó))的免疫熒光染色，觀察神經(jīng)元樣細(xì)胞的生成情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次每樣品設(shè)置6個(gè)重復(fù)。

將所需材料從培養(yǎng)板中取出，放入新的培養(yǎng)板中，用PBS沖洗1次去除殘留的溶液。每片材料加入事先配制好的固定液1(2%tritonX-100，0.5%甲醛-PBS溶液)200 μl浸泡5 min，PBS沖洗1次，加入固定液2(4%甲醛-PBS溶液)200 μl浸泡20 min。PBS沖洗3遍去除殘留溶液，每孔200 μl加入1%BSA-PBS，置于37 ℃恒溫箱中封閉1 h。取出后每孔加入200 ul一抗兔抗大鼠Nestin-IgG，MAP2-IgG(用1%BSA稀釋200倍)置于4 ℃冰箱中過(guò)夜。取出樣品，用PBS漂洗，每孔加入200 μl加入ALexa-Fluor 488標(biāo)記的羊抗兔二抗(用1%BSA稀釋200倍)，在避光條件下置于37 ℃恒溫箱中孵育1 h。染細(xì)胞核，取出樣品，PBS漂洗后每孔加入50 μl加入Hoechst 33342(Sigma公司，美國(guó))，室溫下避光孵育30 mins。最后用PBS漂洗后封片置于光共聚焦顯微鏡下觀察(北愛爾蘭Andor公司)。

1.5 大鼠脊髓損傷模型的建立 成年SD大鼠48只，體重200～250 g，雌雄不限，隨機(jī)分為4組，聯(lián)合組12只，纖維膜植組12只，干細(xì)胞組12只，空白組12只。大鼠以2%戊巴比妥鈉(Sigma公司，美國(guó))(2 ml/kg)腹腔麻醉后，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，取后正中切口，逐層顯露T8-10椎板，行全椎板切除，暴露出硬脊膜，采用改良的Allen重物打擊法[5]，在硬脊膜表面放置一直徑約3.0 mm的圓形墊片，用重10 g的銅制重物沿玻璃導(dǎo)管從25 mm高處垂直自由下落擊打在墊片上，造成脊髓損傷。打擊后大鼠出現(xiàn)擺尾反射，雙下肢及軀體回縮樣撲動(dòng)，麻醉清醒后雙下肢弛緩性癱瘓為造模成功。PLLA聯(lián)合干細(xì)胞移植組在造模后在損傷部位周圍，植入有干細(xì)胞黏附的PLLA納米纖維膜，PLLA納米纖維移植組在損傷部位周圍，植入PLLA納米纖維膜，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植組在損傷部位周圍，植入5 μl的干細(xì)胞懸液，密度約105/μl，空白組損傷部位周圍，植入5 μl的培養(yǎng)液。逐層縫合切口。術(shù)后予以大鼠5萬(wàn)U青霉素肌注預(yù)防感染，每日1次，連續(xù)3 d，注意保暖，分籠飼養(yǎng)，每天2次行膀胱按摩協(xié)助排尿直至建立反射性排尿。

1.6 運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 于術(shù)后2、4、8周對(duì)大鼠進(jìn)行BBB功能評(píng)分[6]，由非本組實(shí)驗(yàn)人員但是熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)者完成。

2 結(jié) 果

2.1 干細(xì)胞的培養(yǎng)和活性檢測(cè) 無(wú)論是否在PLLA納米纖維膜上的干細(xì)胞，在細(xì)胞接種后4～6 h，可見有圓形、透亮的細(xì)胞貼壁；培養(yǎng)第2～4天可見細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形、成纖維細(xì)胞樣或多角形，呈放射狀，形成小集落。當(dāng)傳到第3代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)較均一，多為長(zhǎng)梭形或紡錘狀。CCK-8檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)后的第1天及第4天，干細(xì)胞的增殖兩組之間的比較無(wú)明顯差異，而第7天的時(shí)候在PLLA膜上的干細(xì)胞增殖是要好于單純培養(yǎng)的干細(xì)胞的(圖1)。

圖1 BMSCs細(xì)胞活性檢測(cè)圖

BMSCs在普通培養(yǎng)皿中以及在PLLA納米纖維膜上培養(yǎng)1、4、7 d后的CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)，從圖中，我們可見在培養(yǎng)后的第1、4天兩組之間的細(xì)胞活性比較未見明顯差異(P>0.05)，培養(yǎng)7 d后，在PLLA納米纖維膜上的BMSCs增殖情況要好于普通培養(yǎng)皿中的BMSCs(P<0.05)

2.2 干細(xì)胞向神經(jīng)方向分化的檢測(cè) 將P3 BMSCs接種至材料上，加入RA誘導(dǎo)后，于24 h后在倒置顯微鏡下觀察，可見部分細(xì)胞胞體開始回縮變小，邊緣不規(guī)整，突起逐漸伸出，呈不規(guī)則或圓形，周邊折光性強(qiáng)。第6天時(shí)，鏡下出現(xiàn)兩種形態(tài)的細(xì)胞，一種細(xì)胞體積較小，胞體兩側(cè)大多伸長(zhǎng)出幾個(gè)短小和一個(gè)較長(zhǎng)的突起；另一種細(xì)胞體積較大，胞體周圍長(zhǎng)出很多放射狀的突起。未在材料上培養(yǎng)的干細(xì)胞，加入RA誘導(dǎo)后，細(xì)胞胞體亦開始出現(xiàn)回縮，以及突起伸出，第6天時(shí)亦可以觀察到兩種形態(tài)的細(xì)胞，但是數(shù)量上較材料組要少(圖2)。

圖2 干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向分化第6天觀察圖(標(biāo)尺：100 μm)

A.在材料上干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向的分化，可見較多的細(xì)胞有神經(jīng)樣細(xì)胞的形態(tài)；B.在普通培養(yǎng)皿中干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向的分化，可見神經(jīng)樣細(xì)胞較少

將P3 BMSCs接種至材料上，加入RA誘導(dǎo)后，3 d后進(jìn)行免疫組化觀察，可見Nestin染色陽(yáng)性而MAP-2染色陰性，6 d后觀察發(fā)現(xiàn)Nestin染色陰性而MAP-2染色陽(yáng)性，對(duì)照組染色與材料組染色情況相似，3 d時(shí)可見Nestin染色陽(yáng)性而MAP-2染色陰性，6 d后觀察發(fā)現(xiàn)Nestin染色陰性而MAP-2染色陽(yáng)性，但是無(wú)論Nestin染色還是MAP-2染色均少于材料組(圖3)。

2.3 大鼠術(shù)后運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分 BBB評(píng)分詳見表1，術(shù)后2周，各組之間比較未見明顯差異，術(shù)后4周，PLLA納米纖維+干細(xì)胞組、PLLA納米纖維組與干細(xì)胞組之間未見明顯差異，均優(yōu)于空白對(duì)照組，術(shù)后8周，PLLA納米纖維+干細(xì)胞組優(yōu)于PLLA納米纖維組及干細(xì)胞組，PLLA納米纖維+干細(xì)胞組、PLLA納米纖維組與干細(xì)胞組，均優(yōu)于空白對(duì)照組。

組別術(shù)后2周術(shù)后4周術(shù)后8周PLLA納米纖維+干細(xì)胞組7.28±2.1512.68±2.4616.46±2.32PLLA納米纖維組6.59±2.2811.26±2.3812.70±2.66①干細(xì)胞組6.47±2.4310.91±2.1712.37±2.35①空白組6.02±2.237.23±2.07②8.29±2.25②

注：與PLLA納米纖維+干細(xì)胞組比較，①P<0.05；與另外三組比較，②P<0.05

圖3 干細(xì)胞向神經(jīng)方向分化的免疫組化圖

A.在PLLA納米纖維膜上的干細(xì)胞經(jīng)RA誘導(dǎo)3 d后的Nestin染色; B.在PLLA納米纖維膜上的干細(xì)胞經(jīng)RA誘導(dǎo)3 d后的MAP-2染色;C.干細(xì)胞經(jīng)RA誘導(dǎo)3 d后的Nestin染色;D.干細(xì)胞經(jīng)RA誘導(dǎo)3 d后的MAP-2染色;E.在PLLA納米纖維膜上的干細(xì)胞經(jīng)RA誘導(dǎo)6 d后的Nestin染色;F.在PLLA納米纖維膜上的干細(xì)胞經(jīng)RA誘導(dǎo)6 d后的MAP-2染色;G.干細(xì)胞經(jīng)RA誘導(dǎo)6 d后的Nestin染色;H.干細(xì)胞經(jīng)RA誘導(dǎo)6 d后的MAP-2染色(標(biāo)尺：100 μm)

3 討 論

利用組織工程技術(shù)修復(fù)受損的脊髓，是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)重要的治療策略。生物材料可以連接受損脊髓的遠(yuǎn)近端，可以誘導(dǎo)再生的軸突從近端長(zhǎng)向遠(yuǎn)端[7, 8]。理想的支架材料應(yīng)該具備易于細(xì)胞黏附、生物相容性好等特點(diǎn)。PLLA具有優(yōu)異的生物材料性能，在生物材料領(lǐng)域中被廣泛應(yīng)用[9]。PLLA是一種無(wú)毒、可生物降解的高分子生物材料.并且具有良好的生物相容性，其降解最終產(chǎn)物為CO2和H2O，中間產(chǎn)物乳酸也是人體正常的糖代謝產(chǎn)物，目前已在多種組織工程領(lǐng)域中應(yīng)用[10]。應(yīng)用靜電紡絲技術(shù)將PLLA制作成納米纖維支架材料，具有高孔隙率及高比表面積，有利于細(xì)胞生存所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，可容納更多的細(xì)胞生存。在脊髓損傷的治療中，生物支架的主要作用是引導(dǎo)細(xì)胞的遷移、增殖、分化及凋亡，且能通過(guò)防止瘢痕形成及聚集生長(zhǎng)因子而促進(jìn)神經(jīng)再生[11]。Matsumoto等[12]研究發(fā)現(xiàn)，PLLA合成膜在脊髓組織中有很好的生物相容性和快速的降解率，Li和Shi[13]報(bào)道，多孔隙的PLLA導(dǎo)管表面積增加，不但可用于周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)，對(duì)于脊髓損傷也有潛在的應(yīng)用價(jià)值。納米纖維支架具有較高的比表面積，Ma和Zhang[14]首次利用液一液相分離技術(shù)成功地制備出了PLLA三維納米纖維支架，纖維直徑為50～500 nm，這種納米纖維支架在促進(jìn)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)，選擇性地增加蛋白質(zhì)吸附，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和礦化方面具有積極的意義。筆者在實(shí)驗(yàn)中亦發(fā)現(xiàn)在體外實(shí)驗(yàn)中，在PLLA納米纖維材料上的干細(xì)胞比在普通培養(yǎng)皿中培養(yǎng)的干細(xì)胞有更好的黏附和增殖能力。

有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)干細(xì)胞與PLLA支架材料復(fù)合培養(yǎng)后，神經(jīng)干細(xì)胞在材料表面生長(zhǎng)良好且黏附緊密，Hoechst染色顯示細(xì)胞形態(tài)正常，未見明顯的凋亡和壞死[15]。神經(jīng)干細(xì)胞在PLLA材料培養(yǎng)14 d后，神經(jīng)元染色顯示細(xì)胞分化良好，且神經(jīng)軸突沿納米纖維方向生長(zhǎng)。類似地，在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)體外誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為神經(jīng)樣細(xì)胞的研究中，PLLA膜上的干細(xì)胞確實(shí)體現(xiàn)了比普通培養(yǎng)皿中的干細(xì)胞有更好更快的分化能力。

種子細(xì)胞和支架材料在組織工程中是兩個(gè)重要的要素。因此，種子細(xì)胞的選擇亦是關(guān)鍵問(wèn)題。BMSCs是骨髓中的一種具有自我增殖、多向分化潛能的細(xì)胞，可分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞和肌細(xì)胞。BMSCs來(lái)源豐富并且在體外易于分離，提純和擴(kuò)增，既避免了自體的免疫排斥反應(yīng)，又不會(huì)引起社會(huì)倫理道德問(wèn)題，同時(shí)它也是基因治療的理想受體細(xì)胞。BMSCs移植后可定向、定位分化為各類功能細(xì)胞，替代補(bǔ)充缺失細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，釋放神經(jīng)遞質(zhì)、產(chǎn)生神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子等，促進(jìn)神經(jīng)組織再生和抑制神經(jīng)變性[16]，在特定的條件下能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞[17]。研究顯示，神經(jīng)損傷后 BMSC 移植可上調(diào)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞的再生以及神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)從而發(fā)揮保護(hù)作用，將 BMSC 移植腦缺血再灌注后，BMSCs可促進(jìn)少突膠質(zhì)細(xì)胞增殖，以及激活 JAK2/STAT3 信號(hào)通道以及激活 MAPK 信號(hào)通道從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[18]。筆者發(fā)現(xiàn)，本研究BMSCs移植在脊髓損傷處對(duì)于大鼠脊髓損傷恢復(fù)是有一定幫助作用的。但是亦有研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植和分化效率很低，并且體內(nèi)不一定能向神經(jīng)細(xì)胞分化，另外其存活率也很低，修復(fù)效果并不理想[19]。細(xì)胞移植與組織工程技術(shù)相結(jié)合，主要是各種生物支架材料的應(yīng)用，不僅可以直接填充脊髓損傷的缺損，而且還可以為BMSCs的遷移和貼附生長(zhǎng)分化提供良好的微環(huán)境[20]。故本研究中，筆者將BMSCs種植于PLLA支架材料上，移植修復(fù)大鼠脊髓損傷，具有良好的修復(fù)效果。筆者在此研究中只是初步應(yīng)用BMSCs復(fù)合支架材料對(duì)大鼠脊髓損傷進(jìn)行了修復(fù)研究，而對(duì)于BMSCs種植在PLLA支架材料上，移植進(jìn)入大鼠脊髓損傷處的生物學(xué)行為，以及修復(fù)機(jī)制等，尚需進(jìn)一步的研究。

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