禹建峰，武燁曄，吳衢敏，鄭明生，黃騰飛，楊國榮

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是世界范圍內(nèi)發(fā)病率第六、死亡率第三的惡性腫瘤[1]。與西方國家不同，我國肝癌的主要病因是慢性乙型肝炎感染，其新發(fā)病例數(shù)約占全球總數(shù)的50%，且發(fā)病率和死亡率呈逐年上升的趨勢[2]。根治性肝切除術(shù)仍然是乙肝相關(guān)肝癌的主要治療方式之一，但其術(shù)后5年的腫瘤復發(fā)率約70%，且針對復發(fā)腫瘤仍缺少有效的干預手段[3, 4]。因此，當下急需探索可能影響肝癌預后的新分子、新靶點，將其轉(zhuǎn)化應用于臨床，以改善肝癌的治療效果。

Notch信號通路主要由4個受體(Notch-1、Notch-2、Notch-3、Notch-4)和5個配體(Jagged-1、Jagged-2、DLL-1、DLL-3、DLL-4)組成[5]?，F(xiàn)階段Notch信號通路的配體或者受體對于不同類型肝臟惡性腫瘤的具體作用及機制仍不明確[6]。Jagged-1蛋白為Notch的配體之一，文獻[7]報道它可能參與了肝癌的進展，其表達可能與西方人群的肝癌預后密切相關(guān)，但其與乙肝相關(guān)肝癌臨床預后的研究甚少。基于此，我們檢測了110例乙肝相關(guān)肝癌組織及其對應癌旁組織中Jagged-1蛋白的表達情況，并分析了其與臨床病理和術(shù)后隨訪資料之間的關(guān)系。

1對象與方法

1.1 對象 收集2008-11至2012-06就診我院并接受肝切除術(shù)治療的肝癌患者110例。其中，男92例(83.6%)，女18例(16.4%)；平均52.5歲，年齡>50歲的72例(65.5%)。納入標準：(1)病理證實為HCC；(2)乙肝表面抗原陽性；(3)術(shù)前未接受其他任何治療；(4)無其他惡性疾病病史；(5)肝功能Child-Pugh分級為A或B；(6)無遠處轉(zhuǎn)移，主要門靜脈或肝靜脈未發(fā)生腫瘤侵犯。排除標準：(1)長期飲酒史、非酒精性脂肪肝疾病及丙肝抗體陽性等；(2)臨床資料不全或術(shù)后失訪；(3)手術(shù)切緣陽性。

根據(jù)術(shù)前影像學對腫瘤的評估，以及血生化值、CTP評分對肝功能的評價制定肝臟切除方案，如果患者全身情況和肝功能均較好、現(xiàn)有的技術(shù)條件下可將腫瘤切除的且術(shù)后有足夠的肝組織剩余，則對患者實施肝切除術(shù)。

1.2 組織芯片蠟塊構(gòu)建 收集患者的癌與癌旁的組織蠟塊，經(jīng)HE染色、芯片的設(shè)計、TMA受體蠟塊的制備、TMA模塊的處理、組織陣塊切片及質(zhì)檢等工序后，最終構(gòu)建成組織芯片。

1.3 免疫組織化學染色 檢測Jagged-1蛋白在肝細胞癌組織及其對應癌旁組織的表達：組織芯片經(jīng)過拷片、脫蠟、梯度脫水、高壓抗原修復、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色及蘇木精復染后，采用雙盲法由兩位研究者對結(jié)果進行組織芯片評分。評分標準如下：陰性為未染色，陽性為細胞漿染棕黃色，PBS液代替一抗設(shè)空白對照。高倍鏡下觀察4個視野，計數(shù)200個細胞，按陽性細胞的百分比進行評分(0分，全陰性或陽性細胞≤5%；1分，陽性細胞6%～20%；2分，陽性細胞21%～50%；3分，陽性細胞>50%)。定義0分和1分為低表達組，2分和3分為高表達組。

1.4 隨訪和觀察終點 患者術(shù)后第1年每月隨訪一次，隨后每3～6個月隨訪一次。隨訪時，常規(guī)檢查全血細胞計數(shù)、凝血功能、肝功能、乙肝病毒抗原和抗體、乙肝病毒DNA定量和甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)水平，常規(guī)進行腹部超聲，CT和(或)MRI每6個月進行一次，如果懷疑有腫瘤復發(fā)或遠處轉(zhuǎn)移則會進一步檢查。腫瘤復發(fā)的診斷標準同最初HCC的診斷標準，復發(fā)的腫瘤采取外科手術(shù)、介入和索拉菲尼等治療手段。本研究隨訪觀察截止日期為2017年6月，患者死亡或腫瘤復發(fā)作為終點事件，總體生存的計算是從手術(shù)到死亡或者最后一次隨訪，腫瘤復發(fā)是從手術(shù)到術(shù)后第一次診斷復發(fā)或轉(zhuǎn)移。入組患者未見非腫瘤死亡病例。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用R語言進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)變量采用Studentt檢驗，分類變量采用χ2檢驗，非正態(tài)分布資料采取Mann-Whitney秩檢驗。壽命表法計算入組患者術(shù)后的復發(fā)率及生存率；生存或復發(fā)曲線由Kaplan-Meier法繪制。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 乙肝相關(guān)肝癌組織及對應癌旁組織中Jagged-1蛋白的表達 Jagged-1蛋白陽性染色主要位于胞漿中，肝癌組織中Jagged-1蛋白高表達率(44.5%)顯著高于對應癌旁組織(22.3%)(χ2=12.16，P<0.0001，圖1)。

圖1 乙肝相關(guān)肝癌組織及其對應癌旁組織中Jagged-1蛋白的表達

A.癌旁組織(SP，×40); B. 癌組織(低表達組)(SP，×40); C．癌組織(高表達組)(SP，×40)；D. 癌旁組織(SP，×400); E. 癌組織(低表達組)(SP，×400); F. 癌組織(高表達組)中的表達(SP，×400)

2.2 Jagged-1蛋白的表達水平與乙肝相關(guān)肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系 Jagged-1高表達和低表達組乙肝病毒DNA載量、總膽紅素、白蛋白、凝血酶原時間、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、甲胎蛋白、肝硬化、腫瘤個數(shù)、BCLC分期等方面無統(tǒng)計學差異，僅MVI這項有統(tǒng)計學差異，高表達組的MVI發(fā)生率高于Jagged-1蛋白低表達組(75.5%vs41.0%，P<0.001，表1)。

2.3 Jagged-1蛋白的表達水平與乙肝相關(guān)肝癌患者臨床預后的關(guān)系 Jagged-1蛋白高表達組與低表達組的1、3、5年總體生存率分別是87.5%、64.1%、46.5% 和 96.7%、84.5%、66.9%，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.0139)；1、3、5年腫瘤復發(fā)率為29.8%、53.6%、65.5% 和18.7%、39.9%、53.8%，差異無統(tǒng)計學意義(P=0.0903, 圖2)。

變量低表達組(n=61)高表達組(n=49)χ2或tP年齡(歲)53.0(45.0～59.0)52.0(43.0～57.0)2.2110.477性別(n;%)0.2590.803 男性52(85.2)40(81.6) 女性9(14.8)9(18.4)HBV-DNA載量(n;%)1.5570.459 ≤104U/ml9(14.8)5(10.2) 104-106U/ml34(55.7)33(67.3) >106U/ml18(29.5)11(22.4)總膽紅素(μmol/L)14.1(11.5～18.3)13.8(9.80～17.4)2.2480.441白蛋白(g/L)40.7(39.3～43.2)41.0(38.3～42.7)1.3820.876ALT(U/L)41.2(29.9～56.5)41.5(32.0～54.2)1.5070.864PT(s)12.3(11.7～13.3)12.1(11.5～12.9)5.1830.222AFP(n;%)1.4730.479 ≤20μg/L21(34.4)21(42.9) >20～400μg/L16(26.2)14(28.6) >400μg/L24(39.3)14(28.6)BCLC分期(n;%)0.7170.515 0/A期35(57.4)32(65.3) B期26(42.6)17(34.7)腫瘤直徑(cm)2.77±0.922.69±0.880.629腫瘤個數(shù)(n;%)<0.0011 156(91.8)45(91.8) 25(8.20)4(8.16)MVI(n;%)13.170<0.001 是25(41.0)37(75.5) 否36(59.0)12(24.5)肝硬化(n;%)2.5030.17 是47(77.0)31(63.3) 否14(23.0)18(36.7)Edmondson-Steiner評分(n;%)2.6680.151 I～II28(45.9)15(30.6) III～IV33(54.1)34(69.4)ChildPugh評分(n;%)4.4840.166 555(90.2)39(79.6) 66(9.84)8(16.3) 70(0.00)2(4.08)

注：HBV-DNA，乙肝病毒DNA；ALT，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶；PT，凝血酶原時間；AFP，甲胎蛋白；BCLC分期，巴塞羅那臨床肝癌分期；MVI，微小血管侵犯。表1中非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)使用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)表達

圖2 乙肝相關(guān)肝癌術(shù)后Jagged-1高表達組與低表達組患者的總體生存率和腫瘤累積復發(fā)率曲線

3 討 論

Notch信號通路作用廣泛，它不僅在正常細胞的增殖、分化及凋亡等方面發(fā)揮了作用，而且還參與了腫瘤新生血管的生成和遠處轉(zhuǎn)移[8]。在肝臟研究領(lǐng)域，Notch信號通路已經(jīng)被證實可能與肝臟血管、膽管的發(fā)育密切相關(guān)，而且還參與了肝臟損傷的修復過程[9]。但是，它對于肝細胞癌的具體作用和機制仍存在爭議：有一些研究認為，它可能促進了HCC的發(fā)生發(fā)展；而另一些研究則認為，它可能抑制了HCC的進展[10]。關(guān)于Jagged-1蛋白相關(guān)研究主要集中在西方人群，而我國肝細胞癌患者的病因與西方不同，主要以慢性乙型病毒性肝炎為主。已有研究報道乙型肝炎X蛋白可能通過活化Notch信號通路，從而參與了乙肝相關(guān)肝癌的進展[11]。鑒于Notch通路上不同配體和受體所激活的下游信號通路在HCC中發(fā)揮的作用是各不相同的[12]，因此我們課題組挑選了Jagged-1蛋白作為研究對象。本研究的結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了乙肝相關(guān)性肝癌組織中Jagged-1蛋白的表達水平升高，且與患者的臨床預后密切相關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，Jagged-1蛋白在部分肝癌組織中較癌旁組織呈相對高表達，并且Jagged-1高表達患者的1、3、5年生存率低于Jagged-1表達水平低的患者，提示Jagged-1蛋白在乙肝相關(guān)肝癌組織中的表達水平與臨床預后相關(guān)。2013年， Razumilava等[13]提出了以Notch信號通路中被激活的不同配體或者受體作為分子標志物，從分子層面對肝臟惡性腫瘤進行重新分型。而本研究結(jié)果也顯示了Notch信號通路的配體Jagged-1蛋白有希望作為一種新的肝臟腫瘤標志物應用于臨床的診斷分型、精準治療及預后分析等。

本研究結(jié)果還顯示，Jagged-1蛋白的表達水平與患者肝癌組織的MVI相關(guān)。肝癌的MVI指僅在鏡下可見的肝癌細胞侵犯門靜脈、肝靜脈或其他由血管內(nèi)皮細胞包繞的微血管，切除標本的總體發(fā)生率21%～57%[14]。肝細胞癌高轉(zhuǎn)移高復發(fā)的特性是影響其遠期療效的主要瓶頸，而MVI是導致肝癌術(shù)后腫瘤復發(fā)的重要危險因素[15]。文獻[7, 16]報道，Jagged-1蛋白可能參與了HCC的發(fā)生發(fā)展，并與肝臟血管的發(fā)育形成密不可分。肝細胞癌是人體最富含血管的惡性腫瘤，現(xiàn)階段以索拉菲尼為代表的抑制血管生成的藥物已廣泛應用于臨床，并取得了一定療效。至今已經(jīng)有多種Notch信號通路相關(guān)的小分子抑制劑和單抗藥物正處于臨床前或早期臨床研究階段，其中Jagged-1的單抗藥物已經(jīng)進入了肝纖維化疾病的Ⅰ期臨床實驗，并展示了出了良好的應用前景[17]。因此，本研究預示以Jagged-1為靶點的相關(guān)治療將同索拉菲尼等抑制血管生成藥物一樣，未來將會在肝細胞癌治療領(lǐng)域有所建樹。

本研究存在以下不足：(1)樣本量偏小，需要多中心的臨床研究進一步證實我們的研究結(jié)果。(2)本研究利用組織芯片進行免疫組化染色，僅從蛋白水平檢測Jagged-1的表達。未來還需要通過體內(nèi)外實驗，從DNA水平、mRNA水平及蛋白水平等多方面對Jagged-1蛋白的功能和作用機制進行深入研究。(3)組織芯片上的腫瘤組織僅為原發(fā)腫瘤的一部分，鑒于腫瘤的異質(zhì)性，組織芯片中Jagged-1的表達水平尚不能完全代替腫瘤整體的表達水平。

綜上所述，Jagged-1蛋白在乙肝相關(guān)肝癌組織中的表達水平增高，且與不良的臨床預后密切相關(guān)，它可能在肝癌的MVI發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用。此項研究為Jagged-1蛋白的臨床轉(zhuǎn)化及應用奠定了理論基礎(chǔ)。

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