張楚晗，宋佳誠(chéng)，馮書風(fēng)，田 青

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院 071001）

1 大腸桿菌的危害

大腸桿菌能引起動(dòng)物的腹瀉，主要表現(xiàn)仔豬黃痢、白痢、腸毒血癥、腸炎和豬水腫病等多種臨床癥狀[3]。還易引發(fā)不同品種、日齡雞的急性敗血癥、肝周炎等多種癥狀，難于治愈、極易復(fù)發(fā)，給畜牧業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重?fù)p失，所以快速鑒別大腸桿菌在日常生產(chǎn)中具有重要的意義。

2 革蘭氏染色法

革蘭氏染色(Gramstain)是細(xì)菌學(xué)中最基本，最重要的鑒別染色技術(shù)，微生物學(xué)家Gram氏于1884年發(fā)明了著名革蘭氏染色法后，100多年來(lái)一直使用著Gram氏發(fā)明的四步法，是各細(xì)菌實(shí)驗(yàn)室經(jīng)常使用而不可缺少的細(xì)菌檢驗(yàn)技術(shù)之一[1]。檢驗(yàn)原理是通過(guò)結(jié)晶紫初染和碘液媒染后，在細(xì)胞壁內(nèi)形成了不溶于水的結(jié)晶紫與碘的復(fù)合物，革蘭氏陽(yáng)性菌由于其細(xì)胞壁厚、肽聚糖網(wǎng)層次多且交聯(lián)致密、不含類脂，故遇乙醇脫色處理時(shí)網(wǎng)孔縮小，因此能把結(jié)晶紫與碘復(fù)合物牢牢留在壁內(nèi)，使其仍呈紫色[2]。而革蘭氏陰性菌因其細(xì)胞壁薄、肽聚糖層較薄且交聯(lián)度差、外膜層類脂含量高，乙醇處理時(shí)以類脂為主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖網(wǎng)不能阻擋結(jié)晶紫與碘復(fù)合物的溶出，因此通過(guò)乙醇脫色后仍呈無(wú)色，再經(jīng)沙黃等紅色染料復(fù)染，就使革蘭氏陰性菌呈紅色。

3 材料與方法

3.1 染色劑

革蘭氏染色液（購(gòu)自濰坊漢唐生物工程有限公司）。

3.2 菌種

培養(yǎng)16h的大腸桿菌。

3.3 革蘭氏染色四步法

做一薄涂片，干燥后火焰固定。加上革蘭結(jié)晶紫染液，作用90s，倒掉染色液后并使用蒸餾水沖洗后干燥。再加上革蘭碘液，作用90s后蒸餾水沖洗，并倒掉多余的水后干燥。之后使用革蘭酒精脫色液脫色，通常30s（視涂片的厚薄而定）后，蒸餾水沖洗后干燥，需注意勿過(guò)度脫色，將會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果[5]。然后以革蘭沙黃復(fù)染液復(fù)染30s，再以蒸餾水沖洗，干燥后置油鏡下觀察。經(jīng)此方法染色，保留革蘭結(jié)晶紫染液的細(xì)菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，初染液被洗脫而使細(xì)菌染上沙黃等復(fù)染液的顏色為革蘭氏陰性菌。

3.4 革蘭氏染色三步法

做一薄涂片，干燥后火焰固定。加上革蘭結(jié)晶紫染液，作用90s，倒掉染色液后并使用蒸餾水沖洗后干燥。再加上革蘭碘液，作用90s后蒸餾水沖洗，并倒掉多余的水后干燥。之后把革蘭氏染色中的第三步脫色和第四步復(fù)染合并一步 ，把兩步的試劑按照1：1的比例混合均勻，作用30s后蒸餾水沖洗并干燥。這樣就可以達(dá)到脫色和復(fù)染的雙重目的，效果良好[4]。

4 結(jié)果與分析

表1 大腸桿菌的革蘭氏染色四步法與三步法的結(jié)果

由表1可以看出，采用四步法的有122次合格，成功率為85.0%，三步法的有137次合格，成功率為97.9%，可得三步法成功率比四步法成功率高12.9%，制片時(shí)間比四步法平均快3min。染色結(jié)果的可靠性一方面因革蘭氏染色的四步法關(guān)鍵在于嚴(yán)格掌握酒精脫色程度，另一方面取決于被檢細(xì)菌的狀態(tài)，新培養(yǎng)的細(xì)菌能保持它本身應(yīng)有的染色性。用傳統(tǒng)的革蘭氏染色四步法，雖然容易接受但第三步乙醇脫色時(shí)間不好掌握，而且所需染色時(shí)間較長(zhǎng)[6]。革蘭氏染色三步法不但染色結(jié)果穩(wěn)定，而且減少了操作步驟，縮短了實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高了成功率。通過(guò)改良的革蘭氏三步法以期為獸醫(yī)工作者提供參考，合理安排時(shí)間，提高效率。建議在實(shí)際操作中，工作人員應(yīng)探索總結(jié)影響試驗(yàn)結(jié)果的各種因素，以保障試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性。