吳 田，藍(lán)增全，王華芳

（1.西南林業(yè)大學(xué) 園林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，云南 昆明 650224；3. 北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083）

植物肌動(dòng)蛋白（Actin）是植物中普遍存在的重要蛋白質(zhì)，參與了細(xì)胞分裂、細(xì)胞形成、胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸、程序化死亡等重要生理功能[1-5]。研究者已經(jīng)在許多高等植物中克隆得到了Actin基因，如茶樹(shù)[6]、向日葵[7]、花生[8]、堿蓬[9]、木薯[10]、芍藥[11]、海州香薷[12]、山藥[13]等。隨著一系列高等植物Actin基因的克隆，發(fā)現(xiàn)這些基因高度相似，氨基酸序列的同源性較高，一般在70%以上[14]，具有組成型表達(dá)、易于擴(kuò)增等優(yōu)點(diǎn)，因此可以作為重要的內(nèi)參基因用于定量、半定量PCR研究中，以比較不同來(lái)源的目的基因表達(dá)量的差異[15]。

諾麗Morinda citrifolia Linn.屬茜草科，在國(guó)外主要分布于美國(guó)的夏威夷、澳大利亞、印度尼西亞、印度的熱帶、亞熱帶等地區(qū)，在我國(guó)可以生長(zhǎng)于西雙版納、海南及臺(tái)灣南部等地區(qū)[16]。諾麗被原產(chǎn)地的人們用作食材和藥物已經(jīng)有2000多年的時(shí)間[17]，諾麗的葉可以止疼消炎[18]，果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的維生素A、維生素C、煙酸、鉀、錳、硒以及其他有效成分[19]，具有較高的保健價(jià)值。近幾年，國(guó)內(nèi)外對(duì)諾麗的研究多專(zhuān)注于其藥用成分、臨床試驗(yàn)等，筆者沒(méi)有檢索到關(guān)于諾麗基因表達(dá)方面的研究，在一定程度上不利于諾麗應(yīng)用機(jī)理的闡述。目前，在GenBank中尚未有諾麗Actin基因的報(bào)道，因此，獲取諾麗Actin基因，分析其表達(dá)特性，以確定其是否能夠作為諾麗內(nèi)參基因使用，對(duì)后續(xù)諾麗功能基因的研究具有重要意義。本研究擬根據(jù)其他植物Actin基因的保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并性引物，以諾麗果實(shí)總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后作為模板，進(jìn)行諾麗Actin基因克隆和序列比對(duì)分析，同時(shí)結(jié)合實(shí)時(shí)熒光定 量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）技術(shù)研究其在諾麗葉片、莖段、花以及不同發(fā)育時(shí)期的果實(shí)中的表達(dá)，旨在為諾麗內(nèi)參基因的確定、諾麗生長(zhǎng)發(fā)育中肌動(dòng)蛋白的作用、其他基因在諾麗中的表達(dá)和調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

將成熟度約80%的諾麗果實(shí)采收后，25 ℃下貯藏2 d后作為基因克隆的植物材料。用于qRT-PCR的植物材料分別為諾麗不同熟期的果實(shí)、諾麗葉片、諾麗全花、諾麗莖段等（表1）。諾麗樣品采自于云南省玉溪市元江縣諾麗種植基地，于保鮮盒中帶回實(shí)驗(yàn)室，除1號(hào)樣品外，其他樣品用液氮速凍，暫存于-70 ℃冰箱待用；1號(hào)樣品于25 ℃下貯藏2 d后用液氮速凍，暫存于-70 ℃冰箱待用。大腸桿菌DH5α菌株由本實(shí)驗(yàn)保存。

表 1 用于本研究的諾麗樣品Table 1 Noni samples used in the research

1.2 主要試劑

柱式Trizol總RNA提取試劑盒（生工B511321）、M-MuLV First Strand cDNA Synthesis Kit M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒（生工B532435）、第一鏈cDNA合成試劑盒（RevertAid Premium Reverse Transcriptase）、LA Taq(TaKaRa DRR02AG)、2×GC Buffer I、Marker（BBI B600032）、柱式DNA膠回收試劑盒（生工B518131）、定量PCR試劑SG Fast qPCR Master Mix（Roche 羅氏）、溴化乙錠、瓊脂糖等均購(gòu)自于上海生工。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總RNA 的提取與反轉(zhuǎn)錄

總RNA的提取按照柱式Trizol總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。總RNA提取后通過(guò)電泳檢測(cè)其完整性，通過(guò)吸光值法檢測(cè)其濃度。cDNA第一鏈的合成按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與合成

通 過(guò) 對(duì) 甜 橙（LOC102622338）、 玉 蘭（AF281323）、 白 樺（EU588981）、 桑 樹(shù)（DQ785808）、白楊（EF418792）等幾種植物Actin基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性比較，找出高度保守的區(qū)段，根據(jù)同源性高和簡(jiǎn)并性低的原則，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物P1：5’-GGAACTGGAATGGTSAAGGCT-3’、P2：5’-CCACATCTGYTGGAAGGTGCT-3’, 其中：S=G/C，Y=C/T，用于擴(kuò)增諾麗Actin 基因片段，預(yù)測(cè)目的片段的長(zhǎng)度為400 bp。根據(jù)上述擴(kuò)增的片段設(shè)計(jì)一對(duì)用于qRT-PCR的引物，上游引物P3：5’-TGTATGGCAACATCGTTCTCAGT-3’，下游引物P4：5’-CCACCTTAATCTTCATGCTGCT-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增長(zhǎng)度111 bp。引物由上海生工合成。

1.3.3 諾麗Actin基因片段的擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系為 25 μL，包括 ddH2O 6.3 μL，2×GC Buffer I 12.5 μL，簡(jiǎn)并引物 P1（10 μmol）、P2（10 μmol）各 0.5 μL，dNTPs（2.5 mM）4 μL，cDNA 1 μL，LA Taq 酶（5 U/μL）0.2 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，33個(gè)循環(huán)后72 ℃充分延伸7 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠、1×TAE電泳緩沖液進(jìn)行檢測(cè)，紫外透射光下觀察并拍照。目的片段的回收和純化按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.3.4 陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定

回收的PCR 產(chǎn)物連接到pMD-18T載體，熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用 LB固體培養(yǎng)基（含有50 μg/mL氨芐青霉素）進(jìn)行篩選，陽(yáng)性克隆經(jīng)菌落PCR 鑒定確認(rèn)后，送至上海生工測(cè)序。

1.3.5 序列的生物信息學(xué)分析

序列的比較、翻譯等在 DNAMAN 生物軟件上進(jìn)行，Blastx在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行。

1.3.6 諾麗Actin基因的qRT-PCR

1.3.6.1 反應(yīng)體系

采用SYBR Green染料法，在Light Cycler 480 Software Setup（Roche 羅氏）熒光定量 PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析。在本課題組進(jìn)行前期qRT-PCR過(guò)程中確定的最佳擴(kuò)增體系（表2）和反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min充分變性后進(jìn)入下述 48 個(gè)循環(huán)，95 ℃ 7 s，57 ℃ 10 s，75 ℃ 10 s。

表 2 諾麗Actin基因的qRT-PCR 反應(yīng)體系Table 2 The qRT-PCR reaction system of noni Actin

1.3.6.2 熔解曲線分析和標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

首先進(jìn)行普通PCR反應(yīng)，得到的PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，以確定得到的產(chǎn)物是否為目的產(chǎn)物，再對(duì)qRT-PCR產(chǎn)物熔解峰進(jìn)行分析。以其中一份陽(yáng)性樣品cDNA 進(jìn)行1倍、10倍、100倍、1 000倍、10 000倍、100 000倍的梯度稀釋作為模板，采用優(yōu)化好的PCR反應(yīng)條件進(jìn)行qRTPCR，取6個(gè)點(diǎn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。由方程E=(10-1/slope-1)×100%計(jì)算出引物的擴(kuò)增效率，擴(kuò)增效率在95%至110%即符合要求。

1.3.6.3 諾麗不同器官及不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)的qRTPCR分析

將諾麗不同組織提取的RNA分別取200 ng進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，然后進(jìn)行qRT-PCR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 諾麗Actin基因片段的克隆

提取的總RNA經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其完整性好、純度高，可以用于諾麗Actin基因的克隆及qRT-PCR分析。以總 RNA反轉(zhuǎn)錄所得到的第一鏈cDNA為模板，P1、P2為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，約在400 bp 處有一條PCR亮帶，與預(yù)測(cè)片段大小一致（圖1），推測(cè)是諾麗Actin基因片段。將該目的片段回收純化，經(jīng)PCR檢測(cè)得到陽(yáng)性克隆，片段大小約為400 bp，可以進(jìn)行測(cè)序。

圖1 諾麗Actin基因的RT-PCR的結(jié)果Fig. 1 RT-PCR of noni Actin

2.2 諾麗Actin基因的序列分析

測(cè)序得到一段393 bp的序列，編碼131個(gè)氨基酸。將該片段在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行Blastx比較，結(jié)果表明其與actin 1（麥藍(lán)菜，Vaccaria hispanica）有最高的一致性（identities）和相似性（positives），分別為96%和98%，與actin4（枇杷，Eriobotrya japonica）、actin 2（姜花，Hedychium coronarium）、actin（ 鵝 掌 楸，Liriodendron tulipifera）、actin（枸杞，Lycium chinense）等均有較高的一致性和相似性（圖2），進(jìn)一步表明克隆得到的是諾麗Actin基因片段。

圖2 諾麗Actin氨基酸序列與其他植物Actin氨基酸序列比對(duì)Fig.2 Homology comparison of Actin amino acid sequences between noni and other plants

2.3 諾麗Actin基因的定量分析

利用P3和P4引物進(jìn)行普通 PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為111 bp，與預(yù)期長(zhǎng)度一致，無(wú)引物二聚體和非特異條帶（圖3）。對(duì)熒光定量RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行熔解峰分析（圖4），諾麗Actin基因片段在Tm=82 ℃處顯示特異性單峰，進(jìn)一步說(shuō)明擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)引物二聚體及非特異性擴(kuò)增，同時(shí)也說(shuō)明引物設(shè)計(jì)的合理性和特異性，PCR反應(yīng)條件得到了較好的優(yōu)化。

圖3 引物P3和P4在諾麗cDNA中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 The ampli fi cation results of primers P3 and P4 in noni cDNA

圖4 諾麗Actin基因的熔解峰Fig. 4 Melting curve of noni Actin

2.4 諾麗Actin基因的qRT-PCR體系

以其中一份陽(yáng)性 cDNA 樣品梯度稀釋后進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，得到了擴(kuò)增曲線（圖5）和標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6）。結(jié)果表明，以Ct值作為縱坐標(biāo)（Y），以稀釋倍數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（X）建立的相對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，在所使用的濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系（R2=0.997 4），擴(kuò)增效率為101.4%。

圖5 諾麗Actin基因梯度稀釋后的qRT-PCR擴(kuò)增Fig.5 qRT-PCR Ampli fi cation of noni Actin after gradient dilution

圖6 諾麗Actin基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 Standard curve of noni Actin

2.5 諾麗Actin基因在諾麗不同器官及不同發(fā)育時(shí)期果實(shí)中的表達(dá)分析

qRT-PCR的結(jié)果表明，諾麗Actin基因在不同熟期的諾麗果實(shí)（1-6號(hào)樣品）中的Ct值分布在21.9～23.2，其中在完全成熟的諾麗果實(shí)中的Ct值最大，基因表達(dá)豐度最低；諾麗Actin基因在不同幼嫩程度的諾麗葉片（7-9號(hào)樣品）中的Ct值分布在23.7～24.5，Ct值相近，說(shuō)明該基因在不同幼嫩程度的諾麗葉片中表達(dá)量基本一致；諾麗Actin基因在全花和莖中的Ct值分別為21.2和21.7，表達(dá)量基本一致。由此可知，諾麗Actin基因在諾麗的各個(gè)組織、果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期都有表達(dá)，因此推斷諾麗Actin基因?yàn)榻M成型表達(dá)的肌動(dòng)蛋白基因，適宜將其作為研究諾麗其他基因表達(dá)的內(nèi)參基因。

3 討 論

如果要進(jìn)行基因表達(dá)量的研究，不論是半定量RT-PCR還是qRT-PCR，首先要找到相應(yīng)的內(nèi)參基因進(jìn)行校正和標(biāo)準(zhǔn)化，主要是為了盡量避免不同樣品在RNA質(zhì)量、反轉(zhuǎn)錄效率和PCR反應(yīng)條件上的差異[20-21]。在qRT-PCR分析中，可以有多種類(lèi)型的看家基因作為內(nèi)參基因，如甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因（Glyceral-Dehyde-3-Phosphate Dehydrogenase，GAPDH）、 微 管 蛋 白 基 因（α-Tubulin）、肌動(dòng)蛋白基因（Actin）、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（Elongation Factors 1 alpha，EF-lα）、泛素基因（Ubiquitin）、18S rRNA基因等[22-23]。但在大多植物的表達(dá)研究中，Actin基因家族是使用最頻繁的看家基因，因?yàn)槠湓诤塑账岷桶被崴骄哂懈叨鹊谋Ｊ匦院屯葱?，且在各組織器官中表達(dá)恒定[24-25]。鑒于此，本研究首先考慮用諾麗Actin基因作為研究諾麗基因表達(dá)的內(nèi)參基因。

本研究克隆了諾麗Actin基因，填補(bǔ)了諾麗內(nèi)參基因研究領(lǐng)域的空白，豐富了高等植物Actin基因數(shù)據(jù)庫(kù)，為進(jìn)一步深入研究植物Actin的功能、保守結(jié)構(gòu)域、變異性及其起源進(jìn)化等提供了新的數(shù)據(jù)。其他研究者再進(jìn)行諾麗基因表達(dá)研究時(shí)，可以直接使用P3、P4作為熒光定量PCR引物，也可以借鑒本研究測(cè)序得到的序列自行設(shè)計(jì)符合相應(yīng)研究所需的qRT-PCR引物。本研究還考察了諾麗Actin基因的qRT-PCR表達(dá)模式，通常理想的內(nèi)參基因除了能在各組織細(xì)胞及各種處理下穩(wěn)定表達(dá)外，其表達(dá)豐度還不應(yīng)過(guò)高，qRT-PCR過(guò)程中，內(nèi)參基因的Ct值一般應(yīng)在15～30之間，太大或太小都會(huì)降低定量的準(zhǔn)確性[26]，本研究在反轉(zhuǎn)錄RNA量為200 ng條件下，諾麗的Ct值均在21～24，表明表達(dá)豐度適宜，Actin基因適合做諾麗的內(nèi)參基因。

然而，隨著植物內(nèi)參基因的研究深入，越來(lái)越多的研究表明，在同一植物中同一內(nèi)參基因的穩(wěn)定性在不同生理?xiàng)l件下通常并不恒定，且在不同物種中同源的內(nèi)參基因也沒(méi)有絕對(duì)的通用性，因此，在所有條件下都穩(wěn)定表達(dá)的理想內(nèi)參基因并不存在[27]。在qRT-PCR分析中，同時(shí)使用兩個(gè)或多個(gè)內(nèi)參基因有助于調(diào)整系統(tǒng)偏差，更有利于得到準(zhǔn)確的基因表達(dá)結(jié)果[28]。因此，后續(xù)研究可以調(diào)取諾麗其他內(nèi)參基因，如GAPDH基因、18S rRNA基因、α-tubulin基因、Ubipuitin基因等，同時(shí)利用BestKeeper、geNorm和NormFinder等內(nèi)參基因分析軟件，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行篩選，為諾麗基因表達(dá)研究提供穩(wěn)定的、可靠的和重復(fù)性高的最優(yōu)內(nèi)參基因。

圖7 諾麗Actin基因的擴(kuò)增曲線Fig.7 Ampli fi cation curve of noni Actin

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