黃鳳，唐國琳，洪容容，李衛(wèi)東，蔣桂華

大黃為中醫(yī)臨床常用大宗藥材，具有清熱瀉火、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)、利濕退黃的功效[1]。唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.是中藥大黃基原之一，主要以種子繁殖。近年來，野生的唐古特大黃資源蘊藏量在急劇下降[2-3]，栽培唐古特大黃替代野生唐古特大黃成為其藥材來源是保證其資源可持續(xù)利用的有效途徑。唐古特大黃的種植在甘肅、四川等地已漸成規(guī)模，然而一些地區(qū)的管理仍較為粗放，種質(zhì)質(zhì)量參差不齊，甚至出現(xiàn)混雜現(xiàn)象[4]。因此，有必要對唐古特大黃種子質(zhì)量進行研究，制定可行的評價指標及分級標準，確保栽培唐古特大黃藥材質(zhì)量。

1 材料

1.1 樣品來源

在唐古特大黃主產(chǎn)地共收集了13批種子，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學蔣桂華教授鑒定為蓼科唐古特大黃Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.的種子，具體信息如表1。

表1 13批唐古特大黃種子來源

3 四川省白玉野生 BYY1 陰干4 四川省白玉野生 BYY2 陰干5 四川省白玉野生 BYY3 陰干6 四川省白玉野生 BYY4 陰干7 甘肅省甘南栽培 GNZ 陰干8 四川省黑水栽培 HSZ 3年 陰干9 四川省茂縣栽培 MXZ1 3年 陰干10 四川省茂縣栽培 MXZ2 2年 陰干11 四川省茂縣栽培 MXZ3 2年 陰干12 四川省石渠野生 SQY 陰干13 四川省小金野生 XJY 陰干

1.2 儀器與試劑

LKTC-BI-T數(shù)顯電子恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）、GTOP系列智能光照培養(yǎng)箱（浙江托普儀器有限公司）、DZG-6090真空干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司BP121S電子天平）、Sartorlus00000792-1精密電子天平（盛博電子衡器有限公司）；0.1%四唑溶液、紅墨水、蒸餾水。

2 方法

2.1 唐古特大黃種子性狀檢測

隨機從種子中選取20粒大黃種子用游標卡尺測量并記錄其長（果實頂端至基部），寬（果實橫切面兩果翅翅緣最大距離），20組長、寬的平均值即視為該產(chǎn)地種子的長度和寬度（精確到0.1mm）。

2.2 唐古特大黃種子凈度

用四分法從袋裝種子中選取30g-35g（至少2500粒種子），用鑷子挑取種子，按照健粒、廢粒（小于半粒）、雜質(zhì)及其他植物種子劃分，最后以健?？藬?shù)占總實驗種子克數(shù)（精確到0.1g）算百分比。

2.3 唐古特大黃種子千粒重測定

選取凈種子2000粒，分兩組各1000粒稱重（精確到0.1g），兩組之間千粒重差值與平均數(shù)之比不超過5%則視為合格，超過則稱量第三份，取3份中差距最小的兩份作為該產(chǎn)地千粒重。在種子含水的情況下，不同產(chǎn)地的種子含水量不同，直接測千粒重不具代表性。所以應使用種子絕對千粒重來衡量種子真實情況，絕對千粒重是種子在含水量為0的情況下測量的千粒重。計算公式為：

種子絕對千粒重=種子千粒重×（1-試樣含水量）

2.4 唐古特大黃種子水分測定

每個產(chǎn)地選取凈種子每組4g-4.5g，進行兩組平行，放入已經(jīng)過恒重3h并稱重的稱量瓶內(nèi)，放置種子厚度為10-15mm，加蓋用電子天平稱量（精確到0.0001g）后放入已預熱的烘箱內(nèi)（開蓋），以105℃的溫度連續(xù)恒重8h，取出蓋蓋放入干燥器內(nèi)放涼30min，稱重計算兩組差值。兩組差值不得超過0.2%，否則重做兩組實驗，直到合格為止。種子水分計算公式為：

種子水分=（烘前試樣重量-烘后試樣重量）/烘前試樣重量×100%

2.5 唐古特大黃種子生活力測定

種子生活里采用四唑（TTC）染色法測定：每個產(chǎn)地取凈種子300粒，分兩組每組100粒用紗布包裹放入裝有蒸餾水的燒杯內(nèi)，用水浴鍋恒溫20℃，浸24h。稱取氯代三苯基四氮唑（紅四氮唑）1g配1000ml蒸餾水搖勻備用。

切種：將泡好的種子用刀片沿著種脊切開，選取含胚較大一半進行染色實驗。

染色：將切好的種子放入盛有四唑溶液的培養(yǎng)皿里，在30-35℃的黑暗環(huán)境中浸泡4h，后用鑷子挑選出胚被染色的半粒。胚被染成紅色著則有生活力，反之則無生活力。生活力計算公式為：生活力=被染種子數(shù)/100×100%，若兩組實驗生活力差值超過5%則需進行第三組實驗直到達到差值要求，取兩組間差值最小的平均值作該產(chǎn)地生活力。

2.6 唐古特大黃種子發(fā)芽率測定

從凈種中選取300粒用紗布包裹放入裝有蒸餾水的燒杯在水浴鍋中恒溫放置24h。

本實驗選用紙上（TP）發(fā)芽法，培養(yǎng)皿（10cm）在使用前需經(jīng)沸水殺毒，減少微生物滋生而影響發(fā)芽效果；選用三層中速濾紙加以蒸餾水潤濕（濾紙潤濕后傾斜可滴一滴水為宜）；從300粒已浸種中選取200粒分四組每組50粒，按一定密度置于濾紙上，蓋蓋置于恒溫20℃亮（12h）暗（12h）交替的培養(yǎng)箱中。每日定時觀察發(fā)芽情況記錄發(fā)芽數(shù)并通氣加蒸餾水。發(fā)芽率的計數(shù)方式為：以首次胚根從種皮中伸出為初次計數(shù)時間，以發(fā)芽后種子連續(xù)三天再無發(fā)芽情況為末次計數(shù)時。依據(jù)本實驗實際唐古特大黃種子的初次計數(shù)時間為第2天，末次計數(shù)時間為第9天。四組4發(fā)芽率在容許誤差內(nèi)則其平均發(fā)芽率為該產(chǎn)地發(fā)芽率，否者重新進行一組實驗。

發(fā)芽率的計算公式為：發(fā)芽率=末次計數(shù)發(fā)芽數(shù)/試樣種子數(shù)×100%

平均發(fā)芽率=4組發(fā)芽率總和/4×100%

2.7 唐古特大黃種子發(fā)芽勢測定

種子在規(guī)定時間內(nèi)開始萌發(fā)的正常種子數(shù)目占供試種子的百分比即為發(fā)芽勢。發(fā)芽勢的計算公式為：發(fā)芽勢=初次計數(shù)正常幼苗數(shù)/試樣種子數(shù)

2.8 相關性分析

采用spss21.0統(tǒng)計分析軟件person相關性分析，研究水分、千粒重、生活力、發(fā)芽率、發(fā)芽勢之間的相關性。

2.9 唐古特大黃種子分級研究

在進行相關性分析的基礎上，采用K-均值聚類法對差異顯著且能直接影響唐古特大黃種子質(zhì)量的指標作為種子質(zhì)量分級的指標，初步進行聚類分級。

3 結果

3.1 性狀檢測結果

13批唐古特大黃種子的外觀形態(tài)大體一致，矩橢圓形或長橢圓形，大部分為三翅，少部分具兩翅或四翅，顏色大多為棕褐色，少數(shù)為淡紫色或淡褐色，果實基部常留存三裂花萼，具果柄，具長短不一的果臍，果皮較厚且其表面光滑無毛，果實內(nèi)部僅有一顆種子。測量結果如表2。

表2 13批唐古特大黃種子長度、寬度測定（n=20）

3.2 凈度分析結果

如表3所示，本次實驗13批唐古特大黃種子凈度在84.52%～98.06%之間，其中黑水栽培最高為98.06%，白玉野生4號最低為84.52%。

3.3 千粒重測定結果

唐古特大黃種子千粒重波動較大，如表3所示，本次試驗13批唐古特大黃種子千粒重范圍在7.31g～12.76g之間，其中最高為白玉野生12.76g，最低為白玉栽培2號7.31g。

3.4 水分測定結果

13批唐古特大黃種子水分含量較為穩(wěn)定，如表3可知，其范圍在9.07%～9.99%之間，最高為白玉栽培2號9.99%，最低為茂縣栽培3號。

表3 13批唐古特大黃種子凈度、千粒重、水分測量結果

3.5 生活力測定結果

13批唐古特大黃種子生活力在23.00%～99.50%之間（表4），其中最高的為甘南栽培種子，達99.5%，最低為小金野生種子，僅為23.0%。

3.6 發(fā)芽率、發(fā)芽勢測定結果

由表4測定結果可知，13批唐古特大黃種子的發(fā)芽率在6.0%～99.5%之間，發(fā)芽勢在0.5%～59%之間。由實驗記錄得唐古特大黃種子普遍在置種后第2天伸出胚根，置種后第3天種子發(fā)芽達到旺盛時期，第5天子葉從種皮中脫出。

表4 13批唐古特大黃種子生活力、發(fā)芽率、發(fā)芽勢測量結果

3.7 相關性分析結果

由分析結果可知，千粒重、水分與生活力及發(fā)芽率相關性不大，而生活力與發(fā)芽率成極顯著正相關（如表5所示）。

表5 13批唐古特大黃種子6項指標相關性分析結果

**. 在0.01 水平（雙側）上顯著相關。

3.8 種子質(zhì)量分級結果

根據(jù)測定結果及相關性分析，將唐古特大黃凈度、千粒重、生活力作為分級指標，設定3個分類等級。方差分析表明，唐古特大黃種子凈度、千粒重在四個類別中呈現(xiàn)顯著差異，說明對種子分級起作用的為凈度及發(fā)芽率。由于考慮到千粒重是種子本身的差異，在制定唐古特大黃種子等級質(zhì)量標準時仍作為指標。根據(jù)聚類分析結果（見表6 ），13批唐古特大黃種子初步分為3級。1、2級種子為合格種子，需同時滿足三個質(zhì)量指標；不符合1、2級標準的即為三級種子，為不合格種子；13批唐古特大黃種子合格率為84.61%。

表6 唐古特大黃種子分級標準

4 討論

本實驗考察了唐古特大黃種子浸種溫度（20℃、25℃、30℃）及發(fā)芽溫度（20℃、25℃），最終得到其發(fā)芽實驗適宜浸種溫度為20℃浸種12h。由于發(fā)芽溫度20℃與25℃無明顯差異，本次實驗選用發(fā)芽溫度為20℃。對四唑染色與紅墨水染色效果進行了對比，結果顯示四唑染色法較紅墨水染色法更能直觀準確判斷大黃種子胚是否被染色，因此本實驗采用四唑染色法結果用以分析13批唐古特大黃種子生活力。

就本實驗13批唐古特大黃種子K-聚類分析結果來看，同一產(chǎn)地的栽培唐古特大黃種子與野生唐古特大黃種子質(zhì)量差異較大，且野生種子質(zhì)量波動較大，這可能與野生大黃生長粗放及野生采種無法判斷生長年限有關。本實驗結果顯示，不同產(chǎn)地栽培唐古特大黃種子質(zhì)量皆呈現(xiàn)出兩年生種子不及三年生，據(jù)文獻可知，唐古特大黃種子一般在移栽后第二年采可進行采種[5-6]，但本實驗結果表明，兩年生種子仍具有一定的利用價值。