荊心研，盧兆蓮，張 婷，胡成進(jìn)，李傳海

肺癌是目前最常見的惡性腫瘤之一，肺癌的發(fā)病率和病死率在惡性腫瘤中位居前列［1，2］，其病死率高的主要原因是早期癥狀不明顯，就診時(shí)大多已處于中晚期，失去最佳的診療時(shí)機(jī)。在Ⅰ期肺癌中經(jīng)手術(shù)治療的患者5年生存率為54%，而未經(jīng)任何治療的患者5年生存率僅為6%［3］。因此，早診斷、早治療是提高5年生存率、改善患者生活質(zhì)量、降低病死率的關(guān)鍵。腫瘤標(biāo)志物與低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描、痰液細(xì)胞學(xué)等結(jié)合可提高肺癌的早期診斷率［4］。肺癌分子標(biāo)志物成為肺癌研究的重點(diǎn)之一，而利用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)腫瘤標(biāo)志物進(jìn)行研究是目前的熱點(diǎn)之一。

1 質(zhì)譜技術(shù)概述

1.1 質(zhì)譜儀簡(jiǎn)介質(zhì)譜儀由進(jìn)樣裝置、離子化源、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器和數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)組成，其中質(zhì)量分析器是該技術(shù)的核心［5］。目前，主要的生物質(zhì)譜技術(shù)包括電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI）和基質(zhì)輔助激光解吸離子化質(zhì)譜，前者一般與四極桿、離子阱質(zhì)量分析器結(jié)合，分別組成電噴霧-四極桿質(zhì)譜、電噴霧-離子阱質(zhì)譜；而后者常與飛行時(shí)間質(zhì)譜結(jié)合，組成基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDITOF-MS）。MALDI-TOF-MS通常用于分析相對(duì)簡(jiǎn)單的肽混合物，而綜合液相色譜ESI-MS系統(tǒng)（LCMS）首選用于分析復(fù)雜的樣品［5］。

1.2 數(shù)據(jù)分析對(duì)實(shí)驗(yàn)獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，是質(zhì)譜分析的重要步驟之一。不同的研究需要不同的數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，如蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，可以通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、生物統(tǒng)計(jì)分析、從頭測(cè)序、翻譯后修飾驗(yàn)證等進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各個(gè)方法都有其各自相應(yīng)的應(yīng)用軟件［6］。

1.3 應(yīng)用優(yōu)勢(shì)質(zhì)譜分析技術(shù)具有敏感度高、特異性好、分析方式靈活等優(yōu)點(diǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)在體、實(shí)時(shí)、在線、高通量的測(cè)試和分析［7］。質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展及日趨成熟使其逐漸從基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)的研究轉(zhuǎn)向輔助臨床診斷。目前很多具備條件的臨床實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)質(zhì)譜儀用于臨床樣本的檢測(cè)，例如MALDI-TOF-MS已成功進(jìn)入臨床微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，成為細(xì)菌鑒定領(lǐng)域突破性的技術(shù)［8］。

2 質(zhì)譜在肺癌分子標(biāo)志物中的探究

肺癌在發(fā)生細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 （如異型細(xì)胞）之前，已伴隨亞細(xì)胞層次的改變，而細(xì)胞和亞細(xì)胞層次改變之前發(fā)生的是分子水平的改變［7］。這些改變可導(dǎo)致血液、痰液、呼出氣、肺泡灌洗液、組織、尿液、唾液等生物樣品中相應(yīng)分子水平的改變。目前許多學(xué)者利用上述各種標(biāo)本結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)對(duì)肺癌特異性的分子標(biāo)志物進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，為肺癌的診斷提供新方法。

2.1 血漿/血清血漿/血清是輔助檢查中常用的樣本，在肺癌分子標(biāo)志物的質(zhì)譜分析研究中應(yīng)用廣泛。Hanas等［9］將Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌患者、肺良性結(jié)節(jié)患者、健康體檢者的血清用電噴霧質(zhì)譜法在質(zhì)荷比為450～1500范圍內(nèi)獲得所有質(zhì)譜峰，并創(chuàng)建數(shù)據(jù)集，根據(jù)留一交叉驗(yàn)證法分析數(shù)據(jù)，該數(shù)據(jù)集中將健康對(duì)照者與肺癌患者、肺良性結(jié)節(jié)患者鑒別的敏感性分別為89%、83%，而Ⅰ期肺癌患者與肺良性結(jié)節(jié)患者鑒別的敏感性為80%，假設(shè)生物分子及其在血清中的量反映了個(gè)體的特定生理/疾病狀態(tài)，那么該實(shí)驗(yàn)有利于開發(fā)篩查工具用以輔助鑒別肺癌高風(fēng)險(xiǎn)患者和肺良性結(jié)節(jié)患者。安娟等［10］用銅離子螯合納米磁珠提取非小細(xì)胞肺癌患者和健康者血清中的多肽，用MALDI-TOF-MS技術(shù)進(jìn)行質(zhì)譜并用統(tǒng)計(jì)軟件分析，建立非小細(xì)胞肺癌的血清多肽分類模型，待大規(guī)模驗(yàn)證后該模型可用于協(xié)助肺癌早期診斷。

質(zhì)譜技術(shù)在脂質(zhì)代謝組學(xué)方面對(duì)肺癌分子標(biāo)志物的探究也存在巨大研究前景。Ren等［11］將487名健康對(duì)照者、479例肺良性疾病患者、474例肺癌患者的血清提取脂質(zhì)后，利用基質(zhì)輔助激光/解吸電離-傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜 （MALDI-FTICR MS）進(jìn)行的分析表明與肺部良性疾病相比，肺癌患者 中 的 C16：0、C16：1、C18：0、C18：1、C18：3、C20：3、C22：6升 高 ，C20：5水平下降，并建立了三個(gè)脂質(zhì)組合：組合 a（C18：2、C20：3、C20：4、C20：5、C22：5、C22：6）， 組 合 b （C18：0、C20：4、C20：5、C22：6）和組合 c（C16：1、C18：0、C18：1、C20：3、C22：6），比較發(fā)現(xiàn)，在肺部良性疾病與肺癌的鑒別中這三個(gè)組合比臨床應(yīng)用的腫瘤標(biāo)志物（CEA和Cyfra21-1）具有更好的診斷能力。

2.2 痰液痰液中含有脫落的上皮細(xì)胞，其細(xì)胞學(xué)分析已經(jīng)用于肺癌的輔助診斷［12］。Zhang 等［13］利用中性解吸提取電噴霧離子化質(zhì)譜（ND-EESI-MS）技術(shù)對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者、健康人以及肺部良性疾病患者的清晨痰標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜峰 m/z 734、756、772、798、803、818為區(qū)分肺癌組與對(duì)照組的主要譜峰。其中m/z 734、756、772經(jīng)碰撞誘導(dǎo)解離后分別被證實(shí)為［DPPC+H］+、［DPPC+Na］+、［DPPC+K］+，而 m/z 798、803分別為磷脂酰甘油、磷脂酰甘油磷酸酯。利用質(zhì)譜技術(shù)尋找肺癌患者痰液中的特異性分子，可為肺癌的診斷提供豐富、有效的信息。

2.3 呼出氣體呼出氣體主要由氮?dú)狻⒀鯕?、二氧化碳、水汽和惰性氣體及痕量組分組成，其中痕量組分由體內(nèi)產(chǎn)生或從外界環(huán)境中吸收的揮發(fā)性氣體組成［14］。呼氣分析具有識(shí)別反映各種呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病機(jī)制炎癥標(biāo)記的潛力，目前質(zhì)譜已經(jīng)應(yīng)用于呼出氣中揮發(fā)性和非揮發(fā)性物質(zhì)的分析［15］。呼氣分析可以在氣相中進(jìn)行，也可以在液相——呼出氣冷凝液中進(jìn)行［15］。呼出氣的分析主要依靠氣相色譜-質(zhì)譜分析法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）。 Dallinga 等［16］利用 GS-MS 對(duì)正常人呼出氣中的揮發(fā)性有機(jī)化合物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)方法的探究及分析，得到正常呼出氣的組成成分，為呼出氣的質(zhì)譜研究奠定了基礎(chǔ)。Filipiak等［17］將肺癌患者與健康對(duì)照者的呼出氣濃縮處理后結(jié)合GC-MS分析研究，檢測(cè)到癌癥患者中濃度較高的揮發(fā)性有機(jī)化合物有23種，其中最重要的是正辛烷、壬烷和2，3-丁二酮；同時(shí)將呼出氣、手術(shù)切除的肺癌組織、肺腫瘤細(xì)胞株分別進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這三種類型的標(biāo)本中檢出的化合物有較高的一致性。Peralbo-Molina等［18］對(duì)肺癌患者、肺癌高風(fēng)險(xiǎn)患者及健康對(duì)照者的呼出氣冷凝液進(jìn)行氣相色譜－飛行時(shí)間質(zhì)譜 （GCTOF/MS）實(shí)驗(yàn)，將三組分別進(jìn)行兩兩對(duì)照實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)肺癌組與高風(fēng)險(xiǎn)組比較，存在4種有差異的化合物；肺癌組與健康對(duì)照組相比較存在3種有差異的化合物；高風(fēng)險(xiǎn)組與健康對(duì)照組比較存在5種有差異的化合物。這些化合物相互結(jié)合為肺癌鑒別診斷提供依據(jù)。對(duì)呼出氣的實(shí)驗(yàn)研究考慮呼出氣中可能存在某些化合物也可以輔助診斷肺癌，但目前尚未在呼出氣中發(fā)現(xiàn)臨床意義明確的腫瘤標(biāo)志物，需要進(jìn)一步深入研究。

2.4 肺泡灌洗液對(duì)于胸部X線片異常的可疑肺癌患者進(jìn)行光纖支氣管鏡檢查，通過(guò)支氣管清洗、支氣管毛刷或支氣管肺泡灌洗液進(jìn)行活組織檢查和（或）細(xì)胞學(xué)檢測(cè)明確診斷［19］。肺泡灌洗液中含有大量脫落細(xì)胞、腫瘤凋亡細(xì)胞、壞死細(xì)胞及腫瘤分泌或釋放的特異性或非特異性蛋白質(zhì)分子，為肺癌的早期診斷提供了新思路［20］。 周繼紅等［20，21］利用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)將周圍型肺癌患者的血清與支氣管活檢肺泡灌洗液進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)肺泡灌洗液中的差異蛋白較血清中多，利用肺泡灌洗液建立分類診斷模型的診斷效率較血清高，可篩查出差異性蛋白作為診斷肺癌的腫瘤標(biāo)志物。Paster等［22］將對(duì)照組、肺癌組、慢性阻塞性肺疾?。–OPD）組及肺癌合并COPD患者各15例的肺泡灌洗液先進(jìn)行二維凝膠電泳，找出差異蛋白，用MALDI－TOF/TOF鑒定，找到15種與氧化應(yīng)激相關(guān)的蛋白，并得出轉(zhuǎn)錄因子NF－κB作用于氧化應(yīng)激蛋白之間參與氧化應(yīng)激反應(yīng)通路，在肺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，為肺癌和COPD的診斷提供新的標(biāo)志物和預(yù)測(cè)工具。Carvalho等［19］收集2014年4月—7月90例可疑肺癌患者的肺泡灌洗液用液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC－MS）分析，經(jīng)2年的隨訪研究，將患者2014年6月和8月分別與之前進(jìn)行評(píng)估對(duì)比，發(fā)現(xiàn)了病例組與對(duì)照組之間存在133種差異表達(dá)蛋白，將這些差異表達(dá)蛋白與文獻(xiàn)報(bào)道的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行比較、總結(jié)，為診斷肺癌提供有意義的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。雖然肺泡灌洗液對(duì)肺癌診斷的敏感性較低（29%～69%），但其特異性高（90%～100%）的優(yōu)點(diǎn)不容忽視［19］。

2.5 肺組織肺組織作為信息量最多的標(biāo)本，在疾病的診斷中具有重要的意義。Li等［23］將肺鱗癌組織與癌旁組織分別磨成粉末后溶于勻漿緩沖溶液后提取膜蛋白，用SDS－PAGE初步分離并進(jìn)行2－DE，選擇差異明顯的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行MALDI－TOF，發(fā)現(xiàn)12種蛋白在肺鱗癌患者中表達(dá)上調(diào)，9種蛋白表達(dá)下調(diào)，其中1種表達(dá)上調(diào)的蛋白和1種表達(dá)下調(diào)的蛋白經(jīng)驗(yàn)證，結(jié)果與2－DE結(jié)果一致。也有學(xué)者利用組織噴霧技術(shù)對(duì)肺癌組織進(jìn)行研究，Wei等［24］將38例肺鱗癌患者的組織及癌旁組織用LTQ－XL質(zhì)譜儀對(duì)組織中的脂類分別進(jìn)行質(zhì)譜分析研究，發(fā)現(xiàn)肺鱗癌患者的組織中5個(gè)強(qiáng)度較高的峰，其m/z分別為：154.03、170.06、798.90、808.49、832.43，在癌旁組織中則找到強(qiáng)度較高的峰：m/z 203.08、757.47、782.52；并發(fā)現(xiàn)結(jié)合偏最小二乘線性判別分析法分析結(jié)果可以快速將癌癥和非癌癥肺組織區(qū)分開，準(zhǔn)確率＞94%。

MALDI－TOF－MS激光束的空間分辨率較高，可用來(lái)研究特定生化化合物在組織上的分布，基于MALDI的質(zhì)譜成像允許組織學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)的表達(dá)，已經(jīng)成為發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的有力工具［25］。基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜用于組織成像技術(shù)（MALDI－MS imaging，MALDI－MSI） 是一種全新的分子成像技術(shù)，它不局限于特異的一種或者幾種分子，可在組織切片中找到多種分子，并提供這些分子在組織中空間分布的精確信息，同時(shí)可對(duì)這些蛋白質(zhì)分子進(jìn)行相對(duì)定量［26］。 MALDI－MSI在腫瘤中的應(yīng)用主要集中在組織蛋白質(zhì)及多肽的研究，傳統(tǒng)常用的分析組織中蛋白質(zhì)的方法可以進(jìn)行腫瘤標(biāo)志物的定量分析，但不能評(píng)估標(biāo)志物內(nèi)分子空間分布情況，免疫組織化學(xué)方法保存了標(biāo)本的空間信息，但前期必須知道腫瘤中的目標(biāo)蛋白以進(jìn)行正確的抗體染色，且一次只能測(cè)定已知的單一蛋白，而質(zhì)譜方法則具有免標(biāo)記、高靈敏性、高特異性、同組分同時(shí)檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)［27］。

2.6 尿液尿液作為人體代謝物排出機(jī)體的重要液體，任何影響體內(nèi)血液成分改變的系統(tǒng)病變均可引起尿液成分的改變。肺癌患者體內(nèi)癌細(xì)胞的代謝物可能會(huì)隨尿液排出體外，尿液輔助診斷肺癌的應(yīng)用價(jià)值有待開發(fā)。An等［28］利用組合式高分辨率液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)肺癌患者的尿液與正常人的尿液分析，鑒定了包括氨基酸、核苷和吲哚代謝物在內(nèi)的11種潛在生物標(biāo)志物。隨著分子物質(zhì)分離方法和現(xiàn)代質(zhì)譜鑒定技術(shù)的快速更新，尿液中蛋白質(zhì)最低檢出限和靈敏度大大提升，尿液腫瘤標(biāo)志物的檢測(cè)簡(jiǎn)便、無(wú)創(chuàng)、患者依從性高，使從尿液蛋白質(zhì)中篩查腫瘤標(biāo)志物成為研究者關(guān)注的新熱點(diǎn)［29］。

2.7 唾液唾液收集的簡(jiǎn)單性及無(wú)創(chuàng)性等優(yōu)點(diǎn)使其成為生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中更具優(yōu)勢(shì)的標(biāo)本，其中除包含口腔疾病的潛在標(biāo)志物，還包含可能影響唾液腺并引起唾液量和組成變化的全身性疾病的潛在標(biāo)志物［30］。 Xiao 等［31］收集肺癌患者與健康人的唾液，將10例肺癌患者和10名健康人的唾液經(jīng)2DE-DIGE/MS后找到16種候選的生物標(biāo)志物，篩選4種蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，在26例肺癌患者和26名健康者的唾液中選取3種蛋白（觸珠蛋白、鋅β2-糖蛋白、人鈣微蛋白）確診實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)3種蛋白聯(lián)合分析的敏感性可達(dá)88.5%，特異性可達(dá)92.3%。研究者還用肺癌和健康人的細(xì)胞株進(jìn)行驗(yàn)證，在肺癌細(xì)胞株中上述3種蛋白的表達(dá)均較健康人高?？梢娡僖涸诜伟┑陌l(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在某些變化，可以作為研究肺癌分子標(biāo)志物的標(biāo)本，一旦唾液中查找腫瘤標(biāo)志物成為常規(guī)檢測(cè)，其簡(jiǎn)便性、無(wú)創(chuàng)性的優(yōu)點(diǎn)將使之成為篩查腫瘤標(biāo)志物的首選標(biāo)本。

綜上所述，肺癌作為我國(guó)常見的惡性腫瘤之一，其致死率占首位［32］，早診斷、早治療是降低其病死率的關(guān)鍵。近年來(lái)，質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速且漸趨成熟，各種技術(shù)與質(zhì)譜結(jié)合尋找肺癌生物標(biāo)志物的研究層出不窮。目前，質(zhì)譜分析在肺癌生物標(biāo)志物的研究方面應(yīng)用廣泛，可分析多種類型的標(biāo)本，如血液、痰液、呼出氣、肺泡灌洗液、肺組織、尿液、唾液等，其研究成果為改善肺癌的診療現(xiàn)狀具有重要意義，質(zhì)譜應(yīng)用于肺癌臨床診斷的時(shí)代已經(jīng)來(lái)臨。

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