陳茂金黃海玲付黨華黃 萃鄔向東*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學動科院，南昌，330045；2.南昌市動物園管理處，南昌，330006)

華南虎(Pantheratigrisamoyensis)是中國的十大瀕危動物之一、國家Ⅰ級保護動物，紅色物種名錄極度瀕危，在野外已滅絕。目前南昌市動物園飼養(yǎng)著20多只圈養(yǎng)華南虎，為更好保護該虎群，采集華南虎新鮮糞便，進行了細菌分離，通過擴增16S rRNA基因片段分析，確定分離到一株遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)。

該菌屬于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，愛德華氏菌屬。為革蘭氏陰性桿菌，無莢膜，是一種人畜共患病[1]病原。1962年首次由日本科學家Hoshina從發(fā)病鰻鱺(Anguillajaponica)體內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)[2]。該菌常發(fā)病于水產(chǎn)動物中，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的危害，造成不可估量的經(jīng)濟損失；其他動物報道較少，尚無從虎腸道內(nèi)分離發(fā)現(xiàn)的報道[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

華南虎糞便，采于江西南昌市動物園內(nèi)一雌性成年華南虎新鮮糞便，糞便偏軟但成形，無其他可見臨床癥狀。

1.1.2 引物

根據(jù)細菌16S rDNA基因序列，設(shè)計特異性引物一對，由上海生工生物有限公司合成，引物序列如下：

16S(F)5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′

16S(R)5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′

1.1.3 主要試劑

小牛血清，杭州江濱生物技術(shù)有限公司；PCR Mix、100bp DNA Ladder購自北京全式金生物科技有限公司；飽和酚、溴化乙啶(EB)購自上海生工生物工程股份有限公司；膠回收試劑盒購自O(shè)mega；Tris堿購自Solarbio公司；SDS、Agarose購自Sigma公司。

1.1.4 主要設(shè)備

SW-CJ凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器、生化培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；5415R冷凍臺式高速離心機，Eppendorf；PCR儀，杭州晶格儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離

無菌操作將約5 g華南虎糞便放入燒杯，并加入95 mL無菌生理鹽水混勻做100倍稀釋；靜置10 min后，取上清做10倍剃度稀釋。選擇10-6、10-7、10-83個稀釋度用無菌棉簽蘸取糞便稀釋液涂布血清培養(yǎng)基，置37℃電熱恒溫箱中培養(yǎng)24 h。從培養(yǎng)基內(nèi)勾取單個、孤立菌落，進行純化獲得菌株；從中選擇典型分離株進行16S rRNA基因的PCR擴增。

1.2.2 細菌16S rDNA鑒定

1.2.2.1 菌液制備

取7支無菌5 mL試管，每支加入3 mL LB液體培養(yǎng)基，分別將7個分離菌株挑單個菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。待培養(yǎng)基渾濁后停止振蕩，取出試管，供提取細菌DNA模板之用。

1.2.2.2 細菌DNA提取

取1 mL對數(shù)期菌液，12 000 rpm離心3 min棄上清。加入0.6 mL TE重懸細菌，12 000 rpm離心3 min棄上清，加入100 μL雙蒸水煮沸12～18 min；再12 000 rpm離心5 min，取上清即為提取細菌DNA模板，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2.3 細菌16S rDNA PCR擴增

擴增體系(25 μL)：16S(F)，1.0 μL；16S(R)，1.0 μL；PCR Mix，12.5 μL；模板 DNA，1.0 μL；ddH2O，9.5 μL；Total 25.0 μL。

PCR 反應(yīng)條件：按上述體系，將引物、PCR Mix、dNTP、細菌DNA模板依次加入無菌 0.2 mL EP管中，將EP管放入PCR儀，蓋好蓋子，調(diào)好擴增條件進行DNA擴增。94℃預(yù)變性5 min，進行擴增循環(huán)，擴增條件94℃ 40 s，55℃ 50 s，72℃ 50 s，33個循環(huán)；最后72℃延伸10 min結(jié)束擴增。

取出反應(yīng)管，從中吸取6 μL在1%的瓊脂糖凝膠中，電泳30 min。在紫外分析儀下觀察擴增結(jié)果，并拍照記錄結(jié)果。

1.2.3 PCR擴增產(chǎn)物送檢測序

將PCR擴增的產(chǎn)物送至南京金斯瑞生物科技有限公司雙向測通測序。

1.2.4 序列分析

將測序得到的7個序列用NCBI中Blast工具進行相似性比較。根據(jù)比較的結(jié)果，選取參考菌株，采用MEGA6.05軟件，用N-J法、ML法、MP法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，并通過自舉分析進行置信度檢測，自舉數(shù)集為1 000。

1.2.5 分離菌株藥敏實驗

麥氏比濁法確定菌液細菌濃度對應(yīng)3號標準管(約9×108/mL)，在血清培養(yǎng)基平板上進行紙片法藥敏實驗，37℃培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈的直徑大小，按照中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準中紙片法抗菌藥物敏感試驗標準來確定菌株對不同藥物的敏感性。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離結(jié)果

分離細菌經(jīng)純化培養(yǎng)獲得24個菌株；分離細菌在血清培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h后菌落形態(tài)大致相似：灰白色、半透明、中間略微凸起、邊緣整齊、表面光滑且濕潤；革蘭氏染色呈陰性，鏡檢呈短桿狀，無芽孢。從中選擇7個典型分離株進行PCR擴增，并分別命名為NCH01～NCH07。

2.2 細菌16S rDNA PCR擴增結(jié)果

7個分離菌株經(jīng)過PCR擴增出約1 500 bp大小的基因片段(圖1)。

圖1 NCH01-NCH07分離菌株16S rDNA擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoretic map of 16S rDNA amplification product of NCH01-NCH07 isolated strain 注：M為100 bp DNA Ladder；1～7分別為菌株NCH01～NCH07 16S rDNA 擴增產(chǎn)物；8為陰性對照 Note：M is 100 bp DNA ladder；1-7 is the 16S rDNA amplification product of strain NCH01-NCH07；8 is a negative control

2.3 測序及序列分析結(jié)果

經(jīng)過PCR擴增的7個分離菌株的16S rRNA基因測序后分別與GenBank中序列進行BLAST比對，結(jié)果顯示分離菌株NCH01、NCH02、NCH04、NCH05、NCH06、NCH07的16S rRNA基因與大腸桿菌(Escherichiacoli)的同源性均達到99%；而NCH03 16S rRNA基因與遲緩愛德華氏菌Su100菌株16S rRNA基因(AB050829.1)同源性達到100%(圖2)。分離菌株NCH03的16S rRNA基因片段長度為1 414 bp(圖3)。

選取遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda)、?？茞鄣氯A氏菌(Edwardsiellahoshinae)、鮰愛德華氏菌(Edwardsiellaictaluri)、沙門氏菌(Salmonellaenterica)、粘放線菌(Moritellaviscosa)、人肺炎桿菌(Cardiobacteriumhominis)菌株與分離菌株NCH03的16S rRNA基因采用鄰接法(Neighbor-Joining)、最大似然法(Maximum likelihood)、最大簡約法(Maximum parsimony)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，結(jié)果都顯示分離菌株NCH03與遲緩愛德華氏菌屬于同一聚類分支，親緣關(guān)系最近?？纱_定分離菌株NCH03為遲緩德華氏菌(圖4)。

圖2 NCH03 16S rRNA基因與遲緩愛德華氏菌Su100菌株16S rRNA基因(AB050829.1)對比圖Fig.2 The Comparison Chart of NCH03 16S rRNA gene with Edwardsiella tarda strain Su100 16S rRNA gene(AB050829.1)

圖3 菌株NCH03 16S rRNA基因部分序列Fig.3 Part of the sequence of the strain NCH03 16S rRNA gene

(a)

(b)

(c)圖4 3種方法構(gòu)建NCH03 16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹(a.N-J法，b.ML法，c.MP法)Fig.4 Three methods of constructing NCH03 16S rRNA gene phylogenetic tree(a.Neighbor-Joining，b.Maximum likelihood，c.Maximum parsimony)

2.4 藥敏實驗結(jié)果

分離菌株NCH03對20種藥物敏感性測定結(jié)果如表1，結(jié)果表明：NCH03菌株對氨芐西林、阿莫西林、替卡西林-克拉維酸、頭孢曲松、慶大霉素、阿米卡星、頭孢噻肟、妥布霉素、氧氟沙星、呋喃妥因敏感；對卡那霉素中敏；對頭孢他啶、四環(huán)素、多西環(huán)素、紅霉素、阿奇霉素、林可霉素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星、諾氟沙星耐受。

表1 分離菌株NCH03對20種藥物的敏感性

Tab.1 Sensitivity of strain NCH03 to 20 kinds of drugs

注：S敏感；I中等敏感；R抗性

Notes：S Sensitive；I Intermediate；R Resistant

3 小結(jié)與討論

本實驗從華南虎新鮮糞便內(nèi)隨機分離到24株菌株，選取7株菌株(命名為NCH01到NCH07)提取其DNA作為模板，通過擴增16S rRNA基因進行同源性分析，初步鑒定菌株NCH03為遲緩愛德華氏菌，其他6株菌株為大腸桿菌。采用菌株NCH03 16S rRNA基因序列進行了系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，以進一步確認菌株NCH03分類地位。結(jié)果表明NCH03與遲緩愛德華氏菌同源性為100%且在系統(tǒng)發(fā)育樹上為一聚類，確定分離菌株NCH03為遲緩愛德華氏菌。NCH03菌株對20種藥物敏感性測定，結(jié)果顯示對10種藥物敏感，9種藥物耐受，一種藥物處于耐受于敏感之間。

本實驗旨在通過對新鮮華南虎糞便菌群進行人工培養(yǎng)和16S rRNA基因擴增測序鑒定，從而反映出華南虎腸道菌群構(gòu)成情況。為判斷圈養(yǎng)華南虎腸道健康狀況提供依據(jù)。對實驗中分離到的一株遲緩愛德華氏菌進行藥敏實驗，實驗結(jié)果為該圈養(yǎng)華南虎治療遲緩愛德華氏菌感染用藥的選擇提供參考，能更好地保護該華南虎群，也為華南虎源遲緩愛德華氏菌后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

遲緩愛德華氏菌廣泛分布在水環(huán)境中，既能感染多種海水淡水魚類，也能感染兩棲動物、爬行動物、哺乳動物等[1，4-6]。宣云峰等[7]從加州鱸(Micropterussalmoide)內(nèi)分離出遲緩愛德華氏菌。鄧顯文等[8]從羅非魚(Oreochromisspp.)內(nèi)分離鑒定了遲緩愛德華菌。周常義[9]等人從兩棲動物牛蛙(Ranacatesbeiana)分離到該菌。陳宗淦，陸亢興等[4-5]發(fā)現(xiàn)人感染遲緩愛德華氏菌的病例。目前尚無華南虎感染該菌的報道。

遲緩愛德華氏菌感染途徑較多，許多動物腸道和水體中都含有該菌，接觸帶毒動物糞便和飲用污染的水源，都可能被感染，從而顯現(xiàn)一些臨床癥狀[10]，嚴重危害動物和人的健康。如牙鲆(Paralichthysolivaceus)感染引起腹部膨脹，內(nèi)有膿液狀腹水，肝腎腫大并伴有出血癥狀[11]；牛蛙感染引起腹水病[9]；海獅感染引起活動異常、采食量減少、無力等；人感染后可引起腸胃疾病、敗血癥等[10]。因此，飼養(yǎng)華南虎時應(yīng)注意飼養(yǎng)環(huán)境衛(wèi)生，勤打掃消毒，飼喂干凈水和食物，防止水和食物被該菌污染。這才能更好地保護華南虎。

目前遲緩愛德華氏菌病治療多以抗生素為主，容易產(chǎn)生耐藥性。本實驗中對華南虎糞便分離菌株NCH03進行藥敏實驗，結(jié)果顯示該菌對20種藥物中的10種耐藥，具有較強的耐藥性。這也加大了保護瀕危動物華南虎的難度。中藥防治疾病時具有副作用小、不易產(chǎn)生耐藥菌的特點。劉克奉等[12]研究了6種中藥對遲緩愛德華氏菌的抑制作用，為使用中藥防治該病提供了重要依據(jù)。

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[3] 葉旭紅，林先貴，王一明.養(yǎng)殖澳洲寶石魚遲緩愛德華氏菌的分離鑒定及致病基因的檢測[J].淡水漁業(yè)，2010，40(1)：50-54.

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[8] 鄧顯文，謝芝勛，劉加波，等.羅非魚遲緩愛德華氏菌的分離與鑒定[J].水生態(tài)學雜志，2009，2(1)：114-117.

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[12] 劉克奉.6種中草藥對2株致病菌的抑菌效果比較[J].水產(chǎn)養(yǎng)殖，2013，34(10)：49-54.