翟少華 賈欽瑞 李淑嫻 姚 剛

(新疆農業(yè)大學動物醫(yī)學學院，烏魯木齊，830052)

牛蛙屬兩棲綱(Amphibia)無尾目(Anura)蛙科(Ranidae)，是一種大型的食用型蛙。目前人工養(yǎng)殖量較大，且具有較高的經濟價值。皮膚作為兩棲動物棲息環(huán)境直接接觸的器官，在進化過程中形成了機體與環(huán)境間的第一道天然屏障，對維持動物自身生存和適應棲息地多樣化的生態(tài)環(huán)境起著重要的作用。牛蛙皮膚顯微結構及組織化學方面的研究已有報道[1-2]，但對于其皮膚的比較組織學及超微結構研究仍鮮見報道。本文通過制作牛蛙皮膚組織的石蠟切片進行蘇木紫-伊紅(HE)染色，通過Masson氏三色法和Mallory磷酸蘇木紫染色法進行特染，及采用透射電鏡技術對牛蛙皮膚不同部位皮膚進行組織學觀察，旨在確定牛蛙皮膚的結構特點，為皮膚及皮下組織細胞間形態(tài)學的研究提供研究基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

健康牛蛙2只，購于新疆烏魯木齊市北園春農貿市場。

1.1.2 實驗試劑

10%中性福爾馬林溶液、無水乙醇、二甲苯、1%氨水、1%鹽酸酒精、伊紅染液、蘇木素染液、固體石蠟、Bouin氏固定溶液、Weigert氏蘇木紫工作液、猩紅-酸性復紅溶液、磷鉬酸-磷鎢酸溶液、苯胺藍溶液、1%冰醋酸溶液、磷鎢酸蘇木紫溶液、0.5%高錳酸鉀溶液、1%草酸溶液、3%重鉻酸鉀溶液、2.5%戊二醛、1%鋨酸、環(huán)氧樹脂、0.1 M PBS緩沖液、甲醛、乙醇、丙酮、1%戊巴比妥鈉、0.2 M磷酸氫二鈉、0.2 M磷酸二氫鈉，均購置新疆烏魯木齊市華利科希實驗試劑公司。

1.1.3 實驗儀器

透射電子顯微鏡(型號為H-600)，購于日本日立公司；生物組織包埋機(型號為BMJ-1)，購于天津天利航空有限公司；控溫儀(型號為KW-1)；生物組織染色機(型號為RS-18Ⅱ)，購于湖北孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司；萊卡2050型石蠟組織切片機(德國萊卡公司)、數顯恒溫水浴鍋(型號為HH-S)，購于江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；光學顯微鏡，購于尼康儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 石蠟切片制備與HE染色

首先將實驗動物牛蛙頸部脫臼處死，從腹白線位置開始剝取動物皮膚組織。牛蛙所取的部位組織是頭部、背部、腰部、腹部、前肢、后肢皮膚于10%的甲醛溶液中固定24 h。固定后將皮膚組織流水沖洗3 h，系列酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋切片，HE染色。

1.2.2 Masson氏三色法染色

將經脫蠟處理的組織切片置于Bouin氏固定溶液，在56 ℃溫箱中1 h，流水沖洗10 min；再經Weigert氏蘇木紫溶液染10 min，流水沖洗10 min；猩紅-酸性復紅溶液染15 min，切片置于蒸餾水中清洗；以磷鉬酸-磷鎢酸溶液染10 min做分色，檢查膠質纖維沒有被染成紅色；使用苯胺藍液做對比染色5 min；以1%冰醋酸分色3 min；以95%酒精，絕對酒精及二甲苯脫水及透明，晾干后封片。

1.2.3 Mallory 氏磷鎢酸蘇木紫染色

將經脫蠟處理的組織切片置于3%重鉻酸鉀溶液氧化作用3 h，輕輕水洗1 min；以0.5%高錳酸鉀溶液氧化作用15 min，迅速通過3次蒸餾水；浸入1%草酸溶液，脫色5 min，流水沖洗3 min；以蒸餾水浸洗，浸入磷鎢酸蘇木紫溶液過夜(或56～60 ℃，90 min)；浸入95%酒精除去殘留染色液，迅速通過3次絕對酒精脫水；浸入二甲苯透明2次，每次2 min，晾干后封片。

1.2.4 透射電鏡樣品制作

實驗動物組織采用2.5%戊二醛固定液固定24 h后，1%鋨酸后固定系列乙醇脫水EPon812包埋，超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，電鏡觀察。

2 結果

2.1 牛蛙皮膚組織HE染色結果

在HE染色中，牛蛙皮膚細胞核呈紫色、膠原纖維呈粉紅色、彈性纖維著色極淺呈淺粉色；在真皮組織中可見數量較多的染色呈嗜堿性、著色較淺、呈淡紫色的成纖維細胞和橢圓形、體積較大的腺體分布(圖1)，主要為黏液腺和顆粒腺；其中黏液腺胞體較小，腺體內有較多的漿液性的分泌液；此外可見有大量的黑色素細胞在表皮下與真皮層之間(圖2)；在黏液腺和黑色素顆粒層之間，有體積較小的顆粒腺存在。在腺體之下有大量的膠原纖維和彈性纖維，而細胞和基質的成分較少，整體結構較為致密。

圖1 牛蛙前肢皮膚：顆粒腺呈橢圓形(HE，10×10)Fig.1 Bullfrog forelimb skin：the granule gland is oval(HE，10×10)

圖2 牛蛙頭部皮膚：黑色素分布于真皮層(HE，10×20)Fig.2 Bullfrog head skin：melanin is distributed in the dermis (HE，10 × 20 )

2.2 牛蛙皮膚組織 Masson氏三色法染色結果

在Masson氏染色法中，牛蛙的表皮中角質層被染成紅色，細胞核呈現黑紫色(圖3)。真皮層的腺體染色呈現粉紅色，膠原纖維呈現藍色，腺體較HE染色更加明顯(圖4)，與腺體下方的膠原纖維形成鮮明的對比。

圖3 牛蛙背部皮膚：表皮層較薄，呈紫色(Masson，10×10)Fig.3 Bullfrog back skin：the epidermis is thinner and purple (Masson，10×10)

圖4 牛蛙背部皮膚：腺體染色呈紫紅色(Masson，10×20)Fig.4 Bullfrog back skin：the gland staining is purple red (Masson，10×20)

2.3 牛蛙和小鼠皮膚組織Mallory氏磷鎢酸蘇木紫染色結果

牛蛙的真皮下層組織有大量的神經分布，在Mallory氏磷鎢酸蘇木紫染色中，膠原纖維呈現紅褐色，彈性纖維呈紫色，在真皮深層及皮下組織中，有大量有被囊的神經末梢，呈圓形或橢圓形，為環(huán)層小體(圖5)。其被囊是由數十層同心圓排列的扁平細胞構成，并且能清晰地看到神經纖維的走向(圖6)，表明牛蛙皮下組織中神經分布較為豐富。

圖5 牛蛙前肢皮膚：由數十層同心圓排列的環(huán)層小體結構，呈橢圓形(Mallory，10×10)Fig.5 Bullfrog skin of bullfrog：the structure of the ring corpuscles arranged in concentric circles of dozens of layers is oval(Mallory，10×10)

圖6 牛蛙前肢皮膚：環(huán)層小體呈橢圓形，神經分布較為密集、豐富(Mallory，10×20)Fig.6 The forelimb skin of bullfrog：the ring body is oval，and the nerve distribution is more dense and abundant(Mallory，10×20)

2.4 牛蛙皮膚組織透射電鏡結果

在電鏡下觀察，可見到基底膜(圖7)，這是表皮與真皮的分割線，將基底層和其下的真皮乳頭層分開(圖8)，基底層位于表皮最深層，其相鄰的細胞之間會通過橋粒進行連接(圖9)。同時可見到形狀呈發(fā)散狀、星狀的黑素細胞(圖10)，在細胞質中會有橢圓形的小體，稱為黑素小體。在真皮層組織中，有大量的血管和神經分布。

圖7 基底膜：表皮與真皮層的分割線(10 000×)Fig.7 Basement membrane：dividing line between the epidermis and the dermis(10 000×)

圖8 基底層：基底層細胞位于最深層(5 000×)Fig.8 Basal layer：basal layer cells are located in the deepest layer(5 000×)

圖9 橋粒：分布于相鄰細胞之間(25 000×)Fig.9 Bridge particles：distributed between adjacent cells(25 000×)

圖10 黑素細胞：呈發(fā)散狀、星狀(8 000×)Fig.10 Melanocytes：divergent，stellate(8 000×)

2.5 牛蛙皮膚部位厚度測量比較結果

利用圖像分析軟件分別測量表皮和真皮的厚度，以微尺讀數進行矯正。運用Excel軟件對測定出來的數據進行初步整理，應用SPSS 21.0軟件單因素方差分析功能對牛蛙不同部位的皮膚進行厚度比較，顯著差異水平為0.05。表1結果顯示：牛蛙皮膚不同部位間存在顯著差異，前肢和后肢部位皮膚厚度差異不顯著，背部和腰部的皮膚厚度差異不顯著，其中頭部皮膚厚度顯著小于其他部位(圖11)。

圖11 牛蛙皮膚厚度差異性比較Fig.11 Compare of bullfrog skin thickness

表1 牛蛙各部位皮膚測量數據結果

Tab.1 Result of bullfrog skin measurements data

3 討論

3.1 牛蛙皮膚表皮組織結構

皮膚是身體最大的器官，也是形成身體連接的外在表面，牛蛙生活于淺水水域環(huán)境及離水不遠的陸地，在水生向陸生的進化中，兩棲類皮膚隨生活環(huán)境的改變而發(fā)生了適應性的改變[3-5]。表皮一般由4～8層細胞構成[6]，由于兩棲類皮膚表皮層細胞的結構特征不像哺乳類那樣明確，因此，暫且將牛蛙表皮細胞類型劃分為3類，即從外向內依次為角質層、中間層(包含了顆粒細胞層和棘細胞層) 和基底層。

牛蛙皮膚表皮角質層的細胞沒有細胞核，輪廓也模糊不清，越往淺層相鄰細胞之間的橋粒解體，角質細胞之間的連接會越松散。顆粒層也稱表皮粒層，位于棘細胞層的上一層，細胞的形狀扁平或者呈梭形，顆粒層的細胞最大的特點就是在細胞質內有無數角質透明質蛋白的無外膜顆粒，稱為透明角質顆粒。棘細胞間有無數的細胞棘突，這些棘突通過橋粒和周圍鄰近的細胞緊密連接，橋粒是無數稱為張絲的中間絲固著點，關于中間絲，通常是圍繞著細胞核開始組裝，并伸展到細胞邊緣與細胞質膜上的細胞連接如橋粒、半橋粒相連[7]?；讓拥募毎姆只鲋衬芰Ψ浅?，會有新生的細胞不斷地向棘細胞層移動，分化成表皮的棘細胞層細胞以及其余幾層細胞。基底膜則是沿著真皮乳頭這些凹凸不平的突起，迂回地覆蓋在表面[8]。

3.2 牛蛙皮膚腺體功能

牛蛙皮膚及其分泌物中包含了種類繁多、功能復雜的生物活性物質，具有特殊的生理和藥理作用，是重要的藥物資源[9]。兩棲類動物皮膚裸露、潮濕，這無疑給微生物提供了一個極好的生存環(huán)境，但在長期的自然選擇過程中，它們逐漸形成了防御機制，即從特定的腺體分泌防御物質到背部、腹部皮膚及腸腔來抵御有害環(huán)境因子的侵襲。因此，兩棲動物皮膚是這些防御物質最為豐富的源泉。牛蛙皮膚的真皮層顆粒腺的數目較多，黏液腺的分布較廣[1]，不同部位的黏液腺和顆粒腺分布也略有不同。黏液腺內腔一般中空，但是會有些腺體細胞脫落進入內腔[2]。黏液腺分泌黏液，分泌的黏液覆蓋在身體的表面形成一層濕潤的薄膜，具有防御、保濕、皮膚呼吸、溫度調節(jié)、pH調節(jié)等作用。顆粒腺分泌部體積較黏液腺大，它分泌的毒素更是可以提供抗菌肽[10]，這些腺體是兩棲動物防御天敵，保護自身，更是捕食的重要手段，是作為兩棲類動物特有的腺體。

4 結論

通過細胞化學染色方法和透射電鏡技術觀察結果顯示，牛蛙表皮結構由內而外依次為基底層、棘細胞層、顆粒層、角質層；在牛蛙真皮層有大量的腺體，主要為黏液腺和顆粒腺，并有大量的黑色素散布于表皮與真皮組織之間。牛蛙皮膚不同部位間存在顯著差異，皮膚各部位厚度差異依次為(腰部>背部>前肢>后肢>頭部)。通過以兩棲類動物牛蛙為研究模型，從皮膚組織顯微和超微形態(tài)學結構的特點，為進一步探討其組織結構與生理功能的關系，以及研究皮膚及皮下組織細胞間物質轉運和信息傳遞提供形態(tài)學研究基礎。

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