張喆，馬云，胡晶紅，蘭紅云，張永清，姚成芳

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟南 250355;2山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所)

大氣污染、香煙煙霧等有害顆?；驓怏w會誘發(fā)肺氣腫、哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)等多種呼吸道慢性疾病[1]。Th17細胞/Treg細胞免疫平衡在慢性氣道炎癥性疾病中扮演著重要角色[2,3]。本草古籍和現(xiàn)代藥典中均有阿膠治療“虛勞嗽咳，肺痿吐膿”等慢性呼吸道炎癥以及“補肺氣，止嗽止痢”的記載，但其作用機制尚不明確。本研究采用香煙暴露法建立氣道炎癥小鼠模型，在此基礎(chǔ)上使用阿膠灌胃，并觀察小鼠肺組織形態(tài)、支氣管肺泡灌洗液(BALF)的炎癥細胞和Th17細胞、Treg細胞亞群比例及IL-6、IL-17A、Foxp3因子表達，探討阿膠對氣道炎癥小鼠肺組織Th17/Treg亞群的影響在治療氣道炎癥方面發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級雄性C57BL/6小鼠24只，體質(zhì)量18～22 g，6～8周齡，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，26 ℃、12 h交替光照飼養(yǎng)，自由進水進食。

1.1.2 主要試劑及儀器 抗小鼠熒光抗體PE-CD3、percp-cy5.5-CD8、percp-CD4、APC-cy7-IL-17A、APC-INF-γ、PE-IL-5、PE-cy5.5-CD25、PE-Foxp-3均購自eBioscience公司；人外周血淋巴細胞分離液購自TBD sciences公司；TRIzol Reagent、2×Es Taq Master-Mix、dNTP、RNase、5×Buffer購自北京康為世紀生物科技有限公司；M-MLV購自Invitrogen公司，RNA酶抑制劑購于BioBasic公司，二乙基焦碳酸酯(DEPC)、瓊脂糖購于AMRESCO公司；丙酮、氯仿、異丙醇、無水乙醇購于天津廣成化學(xué)試劑有限公司;內(nèi)參照GAPDH、IL-17A、IL-6、Foxp-3引物由上海博尚生物技術(shù)有限公司合成；RIPA裂解液購自Beyotime公司；ELISA IL-17A、ELISA IL-6和ELISA Foxp-3試劑盒均購于聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。梯度PCR擴增儀(TGradient，Biometra，德國)；凝膠成像系統(tǒng)(Alplha ImagerTM2200，美國)；電泳儀(Thermo，美國)；酶標儀(Thermo，美國);FACSCalibur流式細胞儀(Becton Dickinson公司)。

1.2 氣道炎癥動物模型的建立與處理 24只小鼠按隨機數(shù)字法平均分成正常組、模型組和阿膠組。模型組和阿膠組每日兩次香煙煙熏，煙熏量10支/次(5支一組，點燃插入40 cm×30 cm×20 cm自制煙熏箱靜置15 min，待燃盡后按相同方法點燃第二組5支香煙)，每次煙熏時間共30 min，共24周。模型組小鼠每日0.2 mL PBS灌胃，阿膠組每日給予0.2 mL阿膠溶液(0.2 g/mL)灌胃，共24周。正常組常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3 觀察指標

1.3.1 一般情況 觀察各組小鼠精神、體質(zhì)量一般情況。

1.3.2 血清IL-17A、IL-6、Foxp3水平 小鼠摘眼球后取約1.5 mL外周血離心分離上清，使用ELISA Kit試劑盒檢測血清IL-17A、IL-6、Foxp3水平。

1.3.3 BALF細胞分類計數(shù) 取血后脫頸椎處死，解剖分離氣管周圍的組織；氣管作一橫行切口，插入氣管插管，結(jié)扎右主支氣管；經(jīng)氣管插管以10 mL生理鹽水分3次灌洗左肺后，回收的BALF作細胞分類計數(shù)。

1.3.4 肺組織病理 取右肺上葉置于4%甲醛溶液中，按照常規(guī)方法制作石蠟切片，切片使用HE染色來評價其病理改變，具體標準主要參考文獻[4]中的方法來確定。

1.3.5 肺組織Th17細胞、Treg細胞比例 右肺中葉經(jīng)過消化、研磨、破紅、過濾等操作制備單核細胞懸液。調(diào)整單個核細胞濃度(1×106/管)后離心，沉淀用1.5 mL刺激液重懸，轉(zhuǎn)移至24孔板中，于CO2細胞培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)6 h。經(jīng)過濾轉(zhuǎn)移至EP管中，1×PBS洗2次，離心后棄上清，沉淀加入小鼠血清重懸后室溫避光封閉15 min。按說明書參考抗體濃度加入外標抗體(PE-CD3、percp-CD4、percp-cy5.5-CD8、PE-cy5.5-CD25)，4 ℃避光孵育30 min。1×PBS洗2次，加入穿膜固定液500 μL，4 ℃固定30 min，固定后細胞用穿膜液洗2次后加入500 μL穿膜液4 ℃避光孵育30 min。按說明書加入內(nèi)標抗體(APC-cy7-IL-17A、PE-Foxp-3)，4 ℃避光孵育1 h后用800 μL 1%多聚甲醛4 ℃避光12 h。PBS重懸細胞，轉(zhuǎn)管，上機檢測，采用Flowjo7.6分析Th17亞群(CD4+IL-17A+)及Treg亞群(CD4+CD25+Foxp3+)比例。

1.3.6 肺組織IL-17A、Foxp3、IL-6 mRNA表達 將右肺第三小葉置于經(jīng)DEPC處理的EP管中，采用TRIzol Reagent提取樣本總mRNA，采用oligo dT為RT反應(yīng)引物。PCR反應(yīng)條件:RNase free water 6.5 μL，Taq酶12.5 μL，RT反應(yīng)產(chǎn)物4 μL，上、下游特異性引物各1 μL，總體積20 μL。PCR循環(huán)參數(shù):預(yù)變性95 ℃，5 min；94 ℃，1 min;58 ℃，1 min；72 ℃，1 min，30個循環(huán)，末次循環(huán)后72 ℃延長10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%凝膠電泳，結(jié)果采用Alpha凝膠成像系統(tǒng)分析圖像，以GAPDH為內(nèi)參照，以目的基因與同步GAPDH灰度值比值作為相對表達量。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠一般情況 模型組小鼠體質(zhì)量增長緩慢，出現(xiàn)被毛枯黃、脫落、易激惹等表現(xiàn)；阿膠組被毛枯黃、脫落、易激惹現(xiàn)象較模型組相對減輕，體質(zhì)量正常增長。第24周末，正常組、模型組和阿膠組體質(zhì)量分別為(26.51±1.89)、(24.32±1.90)、(26.38±1.96)g，模型組與正常組相比，阿膠組與模型組相比，P均<0.05。

2.2 各組小鼠BALF細胞分類計數(shù)比較 見表1。

表1 各組小鼠BALF細胞分類計數(shù)比較

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.3 各組小鼠肺組織病理結(jié)果比較 正常組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常。模型組小鼠肺間質(zhì)有大量炎性細胞浸潤，肺泡破裂融合，肺泡數(shù)量減少、直徑變大，形成肺氣腫，出現(xiàn)毛細血管擴張和紅細胞滲出，肺間質(zhì)明顯增厚。阿膠組小鼠肺組織炎性細胞浸潤程度明顯降低，肺間質(zhì)增厚不明顯，無紅細胞滲出，肺臟炎癥情況明顯改善，切片與正常組基本一致。

2.4 各組小鼠肺組織Th17細胞、Treg細胞比例比較 見表2。

表2 各組小鼠肺組織Th17細胞、Treg細胞比例比較

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.5 各組小鼠血清IL-17A、Foxp3、IL-6水平比較 見表3。

表3 各組小鼠血清IL-17A、Foxp3、IL-6水平比較

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.6 各組小鼠肺組織IL-17A、Foxp3、IL-6 mRNA表達比較 見表4。

表4 各組小鼠肺組織IL-17A、Foxp3、IL-6 mRNA表達比較

注：與正常組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

3 討論

大氣細顆粒物(PM2.5)污染、吸煙與被動吸煙均是人類COPD發(fā)生的主要危險因素。吸入有害顆?；驓怏w可導(dǎo)致肺部炎癥，炎癥反應(yīng)中被激活的炎癥細胞釋放多種介質(zhì)，這些介質(zhì)能破壞肺的結(jié)構(gòu)和(或)促進中性粒細胞炎癥反應(yīng)，PM2.5還可以加重原有氣道炎癥的發(fā)展[5]。T淋巴細胞亞群及細胞因子表達失衡與COPD發(fā)病的相關(guān)性已被國內(nèi)外諸多研究[4,6]證實，其中Th17細胞/Treg細胞免疫平衡在COPD的免疫學(xué)發(fā)病機制中扮演著重要角色[7]。煙霧等有害顆粒或氣體刺激可引起氣道上皮細胞的損傷，激活抗原呈遞細胞分泌大量IL-1β、IL-6等炎性細胞因子，促使CD4+T細胞向Th17細胞分化增殖介導(dǎo)自身免疫反應(yīng)。同時，Th17細胞分泌IL-17、IL-21、IL-22等促炎細胞因子，募集中性粒細胞和巨噬細胞浸潤至炎癥組織，釋放彈性蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)破壞肺組織。肺組織損傷和基質(zhì)損傷后釋放的彈性蛋白片段同樣可作為自身抗原，刺激更多炎性介質(zhì)釋放，形成“瀑布效應(yīng)”[8]。鼠類實驗和人類研究都表明，Th17細胞因子在COPD小鼠肺組織中的表達顯著上調(diào)[9]，在肺氣腫小鼠肺臟的表達也顯著增加[10,11]。IL-6是Th17細胞刺激上皮細胞和成纖維細胞間接分泌的主要的致炎性因子，同時也是促進Th17細胞分化的調(diào)控因子[12]。IL-6的增加不僅募集中性粒細胞到炎癥部位加劇炎癥反應(yīng)，同時誘導(dǎo)初始T細胞向Th17細胞分化，進一步加重Th17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。調(diào)節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Treg)通過其免疫抑制能力在維持免疫穩(wěn)態(tài)和耐受中發(fā)揮重要作用。機體發(fā)生炎癥反應(yīng)時，會通過上調(diào)Treg亞群抑制機體過強的免疫反應(yīng)來保護宿主，避免因過強的免疫反應(yīng)造成嚴重病理損害，其在炎癥中表達的差異可以間接反映炎癥的嚴重程度[13,14]。

目前，西醫(yī)治療非感染性炎癥主要依賴激素調(diào)節(jié)，但長期使用激素會導(dǎo)致機體免疫功能受到抑制，抗病原微生物及腫瘤監(jiān)視功能降低。本草古籍和現(xiàn)代藥典中均有阿膠治療“咳嗽”的記載，如《本草備要》中有阿膠治療“虛勞嗽咳，肺痿吐膿”的記載，《本草綱目》中有阿膠治療“肺風(fēng)喘促，多年咳嗽”的記載，《本草約言》中有阿膠“補肺氣，止嗽止痢，治痿等劑皆用之，惟久而虛者宜之”的記載，但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對于阿膠治療氣道炎癥的機制研究還處于起步階段。以往研究[15]發(fā)現(xiàn)，阿膠的抗炎機制可能與改善組織血管通透性，降低炎性滲出，提高機體抗氧化能力，減少過氧化物積累，減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用有關(guān)。趙福東等[16]研究結(jié)果顯示，阿膠可以通過降低哮喘模型動物外周血IL-4因子表達水平逆轉(zhuǎn)Th2細胞優(yōu)勢狀態(tài)，從而減輕氣道嗜酸性粒細胞浸潤，但從干預(yù)Th17細胞/Treg細胞亞群失衡角度治療呼吸系統(tǒng)炎癥的作用機制未見文獻報道。本研究采用香煙煙霧暴露法復(fù)制氣道炎癥小鼠模型，探討煙塵暴露下肺臟局部Th17細胞及細胞因子的變化以及阿膠的逆轉(zhuǎn)作用。結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組小鼠肺組織Th17細胞、Treg細胞比例高，血清IL-17A、IL-6、Foxp3水平和肺組織IL-17A、Foxp3、IL-6 mRNA表達高，肺間質(zhì)有大量炎性細胞浸潤，肺泡破裂融合；與模型組相比，阿膠組小鼠肺組織Th17細胞、Treg細胞比例低，血清IL-17A、IL-6、Foxp3水平和肺組織IL-17A、Foxp3、IL-6 mRNA表達低，肺臟炎癥情況明顯改善。

綜上可見，香煙暴露導(dǎo)致的氣道炎癥小鼠肺組織Th17細胞、Treg細胞比例高，阿膠可能是通過減少炎癥部位升高的Th17細胞、Treg細胞比例，逆轉(zhuǎn)Th17/Treg亞群失衡狀態(tài)抑制氣道炎癥而發(fā)揮治療作用。

[1] Hogg JC, Timens W. The pathology of chronic obstructive pulmonary disease[J]. Annu Rev Pathol, 2009,4:435-459.

[2] Shan M, Yuan X, Song LZ, et al. Cigarette smoke induction of osteopontin(SPP1)mediates T(H)17 inflammation in human and experimental emphysema[J]. Sci Transl Med, 2012,4(117):117ra119.

[3] Zhou HB, Hua W, Jin Y, et al. Tc17 cells are associated with cigarette smoke-induced lung inflammation and emphysema[J].Respirology, 2015,20(3):426-433.

[4] 王云鋒,婁云,李國君,等.大氣細顆粒物的毒性效應(yīng)及其機制研究進展[J].毒理學(xué)雜志,2016,30(1):69-72.

[5] Lee J, Taneja V, Vassallo R. Cigarette smoking and inflammation:cellular and molecular mechanisms[J]. J Dent Res, 2012,91(2):142-149.

[6] Perricone C, Versini M, Ben-Ami D, et al. Smoke and autoimmunity: The fire behind the disease[J]. Autoimmun Rev, 2016,15(4):354-374.

[7] Montalbano AM, Riccobono L, Siena L, et al. Cigarette smoke affects IL-17A,IL-17F and IL-17 receptor expression in the lung tissue:Ex vivo and in vitro studies[J]. Cytokine, 2015,76(2):391-402.

[8] Barcelo B, Pons J, Ferrer JM, et al. Phenotypic characterisation of T-lymphocytes in COPD:abnormal CD4+CD25+regulatory T-lymphocyte response to tobacco smoking[J]. Eur Respir J, 2008,31(3):555-562.

[9] Harrison OJ, Foley J, Bolognese BJ, et al. Airway infiltration of CD4+CCR6+Th17 type cells associated with chronic cigarette smoke induced airspace enlargement[J]. Immunol Lett, 2008,121(1):13-21.

[10] Shan M, Yuan X, Song LZ, et al.Cigarette smoke induction of osteopontin(SPP1)mediates T(H)17 inflammation in human and experimental emphysema[J]. Sci Transl Med, 2012,4(117):117ra119.

[11] Zhou HB, Hua W, Jin Y, et al. Tc17 cells are associated with cigarette smoke-induced lung inflammation and emphysema[J].Respirology, 2015,20(3):426-433.

[12] Littman DR, Rudensky AY. Th17 and regulatory T cells in mediatingand restraining inflammation[J]. Cell, 2010,140(6):845-858.

[13] Roos-Engstrand E, Ekstrand-Hammarstrom B, Pourazar J, et al.Influence of smoking cessation on airway T lymphocyte subsets in COPD[J]. COPD, 2009,6(2):112-120.

[14] Roos-Engstrand E, Pourazar J, Behndig AF, et al. Expansion of CD4(+)CD25(+)helper T cells without regulatory function in smoking and COPD[J]. Respir Res, 2011,12:74.

[15] 張飄飄，凌亞豪，閻曉丹,等.阿膠對人工細顆粒物所致大鼠呼吸系統(tǒng)損傷的保護作用[J].癌變·畸變·突變,2017,29(5):364-351.

[16] 趙福東,董競成,崔焱,等.阿膠對哮喘大鼠氣道炎癥及外周血Th1型/Th2型T輔助細胞因子的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2006，12(6):59-61.