程友靜，趙昭亮，符丹丹

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義 563000；2貴州航天醫(yī)院)

磷脂酰肌醇-3激酶(PIK3CA)是脂激酶磷脂酰肌醇-3激酶家族(PI3Ks)蛋白催化亞基的編碼基因。PI3Ks通路是重要的腫瘤相關(guān)通路。PIK3CA突變對(duì)癌癥患者預(yù)后的影響仍然存在爭(zhēng)議，一些研究表明PIK3CA突變有利于癌癥患者的預(yù)后，如乳腺癌[1]。而另外一些研究則表明PIK3CA的突變不利于癌癥患者的預(yù)后，如結(jié)腸癌[2]。到目前為止，有關(guān)PIK3CA突變?cè)邝[狀細(xì)胞肺癌(簡(jiǎn)稱肺鱗癌)患者預(yù)后中作用的研究較少[3]。為豐富PIK3CA作為肺鱗癌治療靶點(diǎn)的理論依據(jù)，本研究分析了大量肺鱗癌患者組織樣本中PIK3CA突變的頻率，并分析PIK3CA突變對(duì)肺鱗癌患者預(yù)后的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2006年1～12月遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治并行手術(shù)治療的肺鱗癌患者308例，其中男206例、女102例，年齡(59±3)歲，中位年齡56歲。所有患者術(shù)前未經(jīng)任何治療，均經(jīng)病理證實(shí)。術(shù)中切除肺腫瘤組織，立即置于RNAlater保存液中，于-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在充分告知可能存在的風(fēng)險(xiǎn)后，與所有患者本人或代理人簽署了知情同意書。

1.2 肺鱗癌組織中PIK3CA基因突變情況觀察 選擇308例肺鱗癌患者組織提取DNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄成RNA，然后加入2 μL EXOSAP酶和5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后測(cè)序。測(cè)序體系為BDV3.1(4 μL)、H2O(3.5 μL)、引物(0.5 μL)、PCR純化產(chǎn)物(2 μL)。測(cè)序條件為90 ℃ 20 s，50 ℃ 30 s，60 ℃ 2 min，共25個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物加入2 μL醋酸鈉和25 μL乙醇充分混勻后離心，2 000 r/min 30 min，棄上清，加入50 μL 75%乙醇離心，2 000 r/min 5 min。小心棄掉上清，室溫干燥10 min，加入20 μL高純度甲酰胺，在PCR儀上進(jìn)行熱變性，95 ℃ 2 min，4 ℃保存。遵循Cobas 4800系統(tǒng)操作手冊(cè)[12]采用Cobas 4800(羅氏，瑞士)測(cè)序，檢測(cè)PIK3CA野生型、突變型。

1.3 預(yù)后隨訪 術(shù)后采用電話、微信等方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪至患者死亡或截止日期，截止日期為2016年12月31日。與術(shù)后影像學(xué)檢查結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)殘肺新發(fā)病灶，符合鱗癌表現(xiàn)者判為復(fù)發(fā)。

2 結(jié)果

2.1 肺鱗癌組織PIK3CA基因突變情況 308例肺鱗癌組織中PIK3CA野生型273例，突變型35例，突變率為11.4%。

2.2 PIK3CA突變與肺鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系 見表1。

表1 PIK3CA突變與肺鱗癌患者臨床病理特征的關(guān)系

注：*采用確切概率法檢驗(yàn)。

2.3 PIK3CA突變與患者預(yù)后的關(guān)系 PIK3CA突變型肺鱗癌患者2、4、6、10年總生存率分別為88.6%、74.3%、62.9%、60.0%，復(fù)發(fā)率分別為91.4%、82.9%、82.9%、82.9%；PIK3CA野生型肺鱗癌患者2、4、6、10年總生存率分別為75.0%、61.0%、50.0%、25.0%，復(fù)發(fā)率分別為75.0%、66.0%、64.0%、60.0%；兩者2、4、6、10年總生存率、復(fù)發(fā)率比較P均<0.05。

3 討論

在所有類型的癌癥中，肺癌是致死率最高的一種，而基因的異常突變是導(dǎo)致肺癌發(fā)生和發(fā)展的主要原因[4]。迄今為止，靶向治療主要應(yīng)用于惡性腫瘤中，其中包括EGFR突變、ALK易位及一些低頻基因(BRAF、ROS1和RET)異常所誘導(dǎo)的癌癥[5～7]。PI3Ks在許多生物學(xué)進(jìn)程中發(fā)揮作用，其中包括絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt的活化，Akt活化后可以進(jìn)一步激活一系列的因子，其中包括mTOR。PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路在調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、增殖和細(xì)胞周期的過(guò)程中具有重要作用，這條通路導(dǎo)致的體細(xì)胞突變經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于癌癥中，可作為癌癥治療的靶點(diǎn)[8,9]。PI3Ks由催化亞基(p110)和調(diào)節(jié)亞基(p85)組成，每一種亞基都有不同的亞型，催化亞基有3個(gè)基因編碼，分別為PIK3CA、PIK3CB和PIK3CD，其中PIK3CA是癌癥患者中最常見的突變類型[7]。PIK3CA中最常見的突變位點(diǎn)主要定位于螺旋結(jié)構(gòu)域上，主要為外顯子9上的E542K和E545K，然后是激酶結(jié)構(gòu)域的突變位點(diǎn)，包括外顯子20上的H1047R[10～12]。研究認(rèn)為，螺旋結(jié)構(gòu)域的突變主要是通過(guò)解螺旋和結(jié)構(gòu)的抑制來(lái)發(fā)揮激活效果，而激酶結(jié)構(gòu)域的突變主要是通過(guò)影響蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜的結(jié)合。本研究結(jié)果顯示，308例肺鱗癌患者PIK3CA基因突變率為11.4%，與癌癥和腫瘤基因圖譜(TCGA)的研究結(jié)果相似。

既往研究[13,14]認(rèn)為，胰腺癌中PIK3CA突變存在于較低的腫瘤階段，尤其是激酶結(jié)構(gòu)域中的突變；且在胰腺癌細(xì)胞系中，與螺旋結(jié)構(gòu)域中的突變相比，激酶結(jié)構(gòu)域中的突變對(duì)于介導(dǎo)體內(nèi)血液內(nèi)滲和肺外滲的能力更低。這種不一致的結(jié)果可能是由不同的組織學(xué)亞型或內(nèi)在分子水平的差異造成的[15～17]。例如，PI3K/Akt因子Akt2僅在鱗癌中存在共擴(kuò)增現(xiàn)象，而完整的PTEN片段缺失存在于大多數(shù)鱗癌中[18]。并且，晚期癌癥中PIK3CA的突變與癌癥的轉(zhuǎn)移有關(guān)，在研究鱗腺癌向腦轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)了PIK3CA的突變[19]。但是，我們并沒(méi)有在所研究的病例中發(fā)現(xiàn)伴隨有PIK3CA突變的轉(zhuǎn)移腦癌。研究[20]發(fā)現(xiàn)，PIK3CA的突變還與乳腺癌的抗藥性相關(guān)，這種突變所造成的影響可能與其對(duì)預(yù)后所造成的影響相反。在PIK3CA突變型的35例患者中，有26例患者沒(méi)有接受輔助化療，這主要是由于他們所患癌癥程度(24例為病理Ⅰ期)和年齡(4例年齡超過(guò)70歲)決定的。本研究結(jié)果顯示，PIK3CA突變多出現(xiàn)于早期肺鱗癌，與文獻(xiàn)[13,14]結(jié)果相似。

研究[21]顯示,腫瘤細(xì)胞中的PIK3CA突變可以激活PI3K/Akt細(xì)胞通路從而調(diào)節(jié)癌癥中的PD-L1表達(dá)。PD-L1是程序性死亡受體1(PD-1)的配體，位于腫瘤細(xì)胞上。PD-1位于免疫細(xì)胞上。PD-L1與PD-1結(jié)合可以激活PD-1/PD-L1通路,抑制T細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸。本研究結(jié)果顯示，PIK3CA突變的肺鱗癌細(xì)胞PD-L1的表達(dá)較低。在PIK3CA突變的胰腺癌和胃癌中也發(fā)現(xiàn)了PD-L1表達(dá)低的現(xiàn)象[22]。本研究結(jié)果顯示，PIK3CA基因突變多出現(xiàn)于早期肺鱗癌，PIK3CA突變肺鱗癌患者預(yù)后較好，可能是由于PIK3CA突變肺鱗癌患者PD-L1低表達(dá)，PD-L1對(duì)免疫細(xì)胞的抑制作用較弱，導(dǎo)致肺鱗癌細(xì)胞不容易產(chǎn)生逃逸而容易被清除，故PIK3CA突變肺鱗癌臨床分期多為早期且預(yù)后較好。

本研究結(jié)果顯示，肺鱗癌PIK3CA突變與吸煙史有關(guān)，有吸煙史的肺鱗癌患者PIK3CA基因突變率明顯高于無(wú)吸煙史的肺鱗癌患者，進(jìn)一步證明吸煙會(huì)導(dǎo)致基因異常突變。

本研究的創(chuàng)新之處在于研究PIK3CA突變的樣本較多、較全，并且在重復(fù)上有時(shí)間的可信賴性(每例患者的跟蹤研究)。

綜上可見，肺鱗癌組織中PIK3CA突變率較高，這種突變可能有助于患者的預(yù)后。

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