余鑫鑫，陳陽(yáng)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430060)

甘草酸提取于植物甘草根莖部位，其分子結(jié)構(gòu)中含有葡萄糖醛酸和甘草次酸，并且水溶性較好[1]。細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甘草酸在抗炎癥、調(diào)節(jié)氧化還原平衡、參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、抗病毒感染、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、保肝護(hù)肝等方面有顯著作用[2]。Lin等[3]研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸分子中含有五環(huán)三萜結(jié)構(gòu)，與糖皮質(zhì)激素具有相似的藥理活性，在治療炎癥和抑制細(xì)胞凋亡方面作用較為顯著，因此在急慢性肝炎、支氣管炎及艾滋病等治療中備受青睞。細(xì)胞凋亡在心血管疾病發(fā)病機(jī)制中起關(guān)鍵的誘導(dǎo)作用，因此在心血管疾病治療中對(duì)心肌上層表皮細(xì)胞凋亡進(jìn)行抑制可以很好地改善疾病。細(xì)胞凋亡受多個(gè)信號(hào)通路程序性調(diào)控，將信號(hào)通路中的蛋白作為藥物治療靶點(diǎn)，可對(duì)相關(guān)通路進(jìn)行抑制，進(jìn)一步抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，改善心臟功能[4]。2016年2～4月，本研究觀察了甘草酸對(duì)缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，并探討其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑及儀器 健康成年雌性SD大鼠50只，體質(zhì)量230～260 g，由巴菲爾生物技術(shù)有限公司提供。甘草酸(Sigma公司，≥99%)；細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(Roche公司)；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(巴菲爾生物技術(shù)有限公司)；兔抗鼠絲分裂原活化蛋白激酶4/7(MKK4/7)、c-Jun氨基末端激酶1/2/3(JNK1/2/3)、磷酸化MKK4/7(p-MKK4/7)、磷酸化JNK1/2/3(p-JNK1/2/3)、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(Caspase)8、B淋巴細(xì)胞瘤2(Bcl-2)蛋白、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、Caspase-3單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，二抗羊抗兔IgG購(gòu)自美國(guó)LI-COR Biosciences公司；電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠)。

1.2 動(dòng)物分組、造模及用藥處理 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組及甘草酸低、中、高劑量組5組，各10只。后四組制備缺血/再灌注大鼠模型，構(gòu)建方法借鑒Zhang等[5]方法。具體方法如下：大鼠術(shù)前禁食24 h，正常飲水。稱重后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，切開(kāi)大鼠頸部，分離左側(cè)頸動(dòng)脈，行頸動(dòng)脈置管。開(kāi)胸并打開(kāi)心包，使心臟充分暴露，在左心耳下1～2 cm處用真絲線穿過(guò)心臟表層，結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈降支，引起心肌缺血，半小時(shí)后松開(kāi)結(jié)扎，使缺血冠狀動(dòng)脈再灌注24 h。關(guān)閉胸腔，縫合后注射青霉素防止感染。缺血大鼠模型構(gòu)建的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是左心室前壁紫紺及同步心電圖Ⅱ?qū)?lián)ST段增高，再灌注模型構(gòu)建評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)是紫紺逐漸紅潤(rùn)及ST段降低1/2，同時(shí)滿足上述兩種情況標(biāo)志著構(gòu)建的缺血/再灌注大鼠模型成功。假手術(shù)組與模型組手術(shù)前處理相同，但只穿線不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈降支。甘草酸低、中、高劑量組在缺血前半小時(shí)分別股靜脈注射30、60、90 mg/kg的甘草酸，假手術(shù)組與模型組注射同體積生理鹽水。在灌注結(jié)束后，低溫條件下迅速剪下各組大鼠心臟，根據(jù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)組織進(jìn)行不同的處理。

1.3 心肌細(xì)胞凋亡率測(cè)算 采用TUNEL法。將各組心肌組織放入二甲苯中脫蠟5～10 min，再次更換新鮮二甲苯繼續(xù)脫蠟5～10 min后，加入無(wú)水乙醇洗去二甲苯，滴加不含DNase的蛋白酶K，20～30 ℃作用半小時(shí)后，PBS洗滌3次，加入含0.1%的Tgiton X-100的PBS，冰浴2 min，然后置于熒光顯微鏡下觀察。根據(jù)陽(yáng)性凋亡心肌細(xì)胞的分布情況，每個(gè)標(biāo)本捕獲10個(gè)視野，記錄每個(gè)視野40個(gè)細(xì)胞中的凋亡細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各組心肌細(xì)胞凋亡率。

1.4 心肌組織中MKK/JNK信號(hào)通路及凋亡蛋白檢測(cè) 采用Western blotting法。取各組大鼠心肌組織，剪碎放入RIPA裂解液中進(jìn)行碾磨提取蛋白。利用BCA試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)所提取蛋白濃度，計(jì)算上樣體積。向蛋白液中加入1/4體積的蛋白上樣緩沖液，充分混勻后于100 ℃變性10 min。每孔加樣量蛋白為25 μg，根據(jù)所檢測(cè)目的蛋白分子量配制10%的SDS-瓊脂糖凝膠。電泳過(guò)程中，濃縮膠電泳時(shí)電壓控制在70 V，分離膠電泳時(shí)電壓控制為120 V；待電泳完成后，在275 mA條件下轉(zhuǎn)膜60 min；完成后將膜浸泡于5%脫脂奶粉中封閉1 h，洗膜，將條帶放入MKK4/7、p-MKK4/7、JNK1/2/3、p-JNK1/2/3、Caspase-8、Bcl-2、Bax、Caspase-3一抗中4 ℃孵育過(guò)夜；再常溫下孵育HPR標(biāo)記的羊抗兔二抗1 h，TBST洗膜3次。用Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜分析蛋白表達(dá)水平。

1.5 心肌組織病理學(xué)觀察 收集各組大鼠心肌組織，經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、制成切片后，先用蘇木精液染色5 min，經(jīng)過(guò)多次洗滌后，再用0.5%伊紅液染色3 min，洗滌后用中性樹(shù)膠封固，光鏡下觀察心肌組織病理改變。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細(xì)胞凋亡率比較 假手術(shù)組、模型組、甘草酸低劑量組、甘草酸中劑量組、甘草酸高劑量組細(xì)胞凋亡率分別為2.34%±0.62%、28.53%±1.95%、23.27%±1.58%、16.27%±1.49%、8.92%±1.87%，假手術(shù)組與模型組相比，后四組兩兩相比，P均<0.05。

2.2 各組心肌組織中MKK/JNK信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較 結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 各組心肌組織中MKK/JNK信號(hào)通路蛋白表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與甘草酸低劑量組相比，cP<0.05；與甘草酸中劑量組相比，dP<0.05。

2.3 各組心肌組織中凋亡蛋白表達(dá)比較 結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各組心肌組織中凋亡蛋白表達(dá)比較

注：與假手術(shù)組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與甘草酸低劑量組相比，cP<0.05；與甘草酸中劑量組相比，dP<0.05。

2.4 各組心肌組織病理學(xué)觀察結(jié)果 假手術(shù)組大鼠心肌纖維正常、細(xì)胞排列分布均勻、細(xì)胞飽滿、細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)，細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)水腫、變性壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組大鼠心肌細(xì)胞排列雜亂無(wú)章，出現(xiàn)較多變性壞死細(xì)胞，細(xì)胞水腫，胞核明顯皺縮，還出現(xiàn)較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。甘草酸低、中劑量組心肌纖維細(xì)胞排列雜亂無(wú)章，心肌細(xì)胞部分出現(xiàn)水腫、空泡，偶爾可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死，細(xì)胞水腫及炎性細(xì)胞較少。甘草酸高劑量組大鼠心肌細(xì)胞排列規(guī)則整齊，細(xì)胞分布均勻，心肌纖維完整性較好，存在輕度間質(zhì)水腫，還可見(jiàn)少許炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。

3 討論

甘草酸具有廣泛的藥理活性，在臨床上的應(yīng)用也較為廣泛?；A(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，甘草酸可以抑制艾滋病病毒增殖，誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，還介導(dǎo)機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等。與此同時(shí)，學(xué)者對(duì)甘草酸藥理作用的相關(guān)研究越來(lái)越多，對(duì)其藥理活性及作用機(jī)制也不斷深入，促使甘草酸的應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴(kuò)大。于是，本文研究了甘草酸對(duì)缺血/再灌注大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響，并對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型組細(xì)胞凋亡率高、Caspase-8表達(dá)高、Bax表達(dá)高、Caspase-3表達(dá)高、Bcl-2表達(dá)低，與模型組相比，甘草酸中劑量組及甘草酸高劑量組細(xì)胞凋亡率低、Caspase-8表達(dá)低、Bax表達(dá)低、Caspase-3表達(dá)低、Bcl-2表達(dá)高。缺血/再灌注會(huì)引起心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，可能是由于缺血/再灌注引發(fā)的缺血缺氧導(dǎo)致心肌組織氧化應(yīng)激損傷，氧自由基的過(guò)度累積會(huì)激活炎性因子的釋放；多種炎癥因子會(huì)通過(guò)作用膜上相關(guān)受體，促使NF-κB向細(xì)胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)多種促凋亡基因(Caspase-8、Bax、Caspase-3)的表達(dá)[6,7]。促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2比例發(fā)生失衡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[8]。甘草酸可以抑制心肌細(xì)胞因缺血/再灌注所引起的凋亡，對(duì)心肌細(xì)胞起到一定的保護(hù)作用。同樣本研究采用HE染色法發(fā)現(xiàn)甘草酸劑量依賴性地減輕心肌組織損傷的病理形態(tài)學(xué)變化。

為了進(jìn)一步研究甘草酸通過(guò)何種信號(hào)通路來(lái)抑制心肌細(xì)胞的凋亡，我們采用了免疫印跡方法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。缺血/再灌注會(huì)引起氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致炎性因子分泌增加。早期也有研究報(bào)道，JNK通路可被多種細(xì)胞因子(如TNF-α、IL-6、EGF等)、應(yīng)激(如紫外線、電離輻射、氧化應(yīng)激等)以及某些G蛋白偶聯(lián)受體激活，參與機(jī)體組織細(xì)胞的凋亡與壞死[9]。程軍等[10]認(rèn)為，JNK信號(hào)通路參與細(xì)胞凋亡，在缺血/再灌注損傷的病理變化過(guò)程中起重要作用，與缺血/再灌注損傷存在高度的相關(guān)性。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)模型組p-MKK4/7、p-JNK1/2/3表達(dá)水平高于假手術(shù)組。缺血/再灌注大鼠MKK4/7/JNK1/2/3信號(hào)通路處于高度活化的狀態(tài)，進(jìn)而誘導(dǎo)了凋亡相關(guān)蛋白水平的改變，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。與模型組相比，甘草酸中劑量組及甘草酸高劑量組p-MKK4/7、p-JNK1/2/3表達(dá)低。由此可見(jiàn)，甘草酸可抑制MKK4/7和JNK1/2/3蛋白的磷酸化水平，進(jìn)而減少心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

[1] 羅燕燕，劉效栓，肖正國(guó)，等.HPLC雙波長(zhǎng)法同時(shí)測(cè)定甘草藥渣提取物中甘草苷、異甘草苷、甘草素、異甘草素及甘草酸含量[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2017，24(12)：64-67.

[2] 馬濤，侯鴻亮，史建峰.復(fù)方甘草酸苷聯(lián)合曲安奈德治療口腔扁平苔蘚的療效觀察[J].中國(guó)藥師，2016，19(3)：545-547.

[3] Lin SC, Chu PY, Liao WT, et al. Glycyrrhizic acid induces human MDA-MB-231 breast cancer cell death and autophagy via the ROS-mitochondrial pathway[J]. Oncol Rep, 2017,89(13-14):422-429.

[4] 李淑娟，吳艷娜，康毅，等．無(wú)創(chuàng)性肢體缺血預(yù)適應(yīng)對(duì)大鼠心肌缺血/再灌損傷后心肌凋亡的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(1)：100-104.

[5] Zhang YG, Song HY, Li Y, et al. Protective effect of GSTT preconditioning on myocardial ischemia-reperfusion injury in rats[J]. Chin Pharmacol Bull, 2010,26(6):714-718.

[6] Ferrari RS, Andrade CF. Oxidative stress and lung ischemia-reperfusion injury[J]. Oxid Med Cell Longev, 2015,15:59-65.

[7] Gong G, Xiang L, Yuan L, et al. Protective effect of glycyrrhizin, a direct HMGB1 inhibitor, on focal cerebral ischemia/reperfusion-induced inflammation, oxidative stress, and apoptosis in rats[J]. PLoS One, 2014,9(3):e89450.

[8] Al-Qathama A, Gibbons S, Prieto JM. Differential modulation of Bax/Bcl-2 ratio and onset of caspase-3/7 activation induced by derivatives of Justicidin B in human melanoma cells A375[J]. Oncotarget, 2017,8(56):95999-96012.

[9] 范為民，王小琴，劉成福.左歸丸對(duì)慶大霉素誘導(dǎo)的腎損傷大鼠MKK4、MKK7、JNK的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合腎病雜志，2013，14(2)：100-103.

[10] 程軍，宋育澤.JNK信號(hào)通路與缺血再灌注損傷的相關(guān)性研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)藥指南，2011，9(28):238-240.

[11] Liang B, Guo XL, Jin J, et al. Glycyrrhizic acid inhibits apoptosis and fibrosis in carbon-tetrachloride-induced rat liver injury[J]. World J Gastroenterol, 2015,21(17):5271-5280.

[12] Haleagrahara N, Varkkey J, Chakravarthi S. Cardioprotective effects of glycyrrhizic acidagainst isoproterenol-induced myocardial ischemia in rats[J]. Int J Mol Sci, 2011,12(10):7100-7113.