瞿敏，茅順洪，繳寶杰，史丹丹，劉香閣，楊強(qiáng)，馬志紅，李慧智

(1滄州市中心醫(yī)院，河北滄州 061001；2滄州市人民醫(yī)院；3泊頭市醫(yī)院)

機(jī)械通氣可加重已有的肺損傷或引起急性肺損傷，稱(chēng)為機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷[1]，該類(lèi)肺損傷常伴有嚴(yán)重的細(xì)胞凋亡[2]。唯BH3域蛋白BID、BIM和PUMA是Bcl-2家族重要的促凋亡因子，在細(xì)胞凋亡中起重要作用[3]。c-Jun氨基末端激酶(JNK)是絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)家族重要成員之一，在肺組織中主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞。研究[3]表明，JNK信號(hào)通路參與了機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷的發(fā)生[4]。甲潑尼龍屬中效糖皮質(zhì)激素，有穩(wěn)定細(xì)胞膜、抗炎和非特異性免疫抑制作用，能有效消除肺間質(zhì)水腫，減輕肺組織細(xì)胞凋亡[5]。本研究通過(guò)制備大鼠大潮氣量機(jī)械通氣急性肺損傷模型，觀察甲潑尼龍預(yù)處理對(duì)大鼠肺的保護(hù)作用，并探討其機(jī)制，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑、儀器 甲潑尼龍(意大利Pfizer Manufacturing Belgium NV公司)，免疫組化測(cè)定試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，酶聯(lián)免疫試劑盒(美國(guó)R&D公司)，Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒(美國(guó)Fermentas Life Science公司)，JNK、p-JNK、BID、BIM、PUMA、Caspase-3一抗(美國(guó)Santa Cruz公司)，二抗山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物科技有限公司)，TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Roche公司)。SAR-1000型小動(dòng)物呼吸機(jī)(美國(guó)Harvard Apparatus公司)，Reveal型Imager圖像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)，i-STAT1型血?dú)夥治鰞x(美國(guó)雅培公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源、分組及處理 SPF級(jí)雄性SD大鼠100只，體質(zhì)量270～320 g，購(gòu)自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(冀)2013-0002，批號(hào)：38000800000421。于恒溫環(huán)境中飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，所有動(dòng)物均按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南進(jìn)行飼養(yǎng)和處理。實(shí)驗(yàn)經(jīng)滄州市中心醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)核實(shí)批準(zhǔn)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將100只大鼠分為C組、V組、Mp1組、Mp2組、Mp3組，各20只，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中出現(xiàn)3只(V組2只，Mp1組1只)大鼠死亡，均排除出本研究，及時(shí)補(bǔ)充3只大鼠至每組20只。C組不行機(jī)械通氣，自主呼吸空氣4 h；V組、Mp1組、Mp2組、Mp3組機(jī)械通氣4 h，機(jī)械通氣前20 min后三組分別靜脈輸注甲潑尼龍2、10、30 mg/kg，V組靜脈輸注等容量生理鹽水。

1.3 機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷模型制備 本研究參照文獻(xiàn)[6]介紹的方法和預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果制備大鼠機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷模型。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前禁夜食12 h，自由飲水，腹腔注射3%戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉下氣管切開(kāi)，插入氣管導(dǎo)管并固定，股動(dòng)脈插管用于監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓和采血，股靜脈插管建立液體通道，麻醉維持采用靜脈輸注戊巴比妥鈉2 mg/(kg·h)。V組、Mp1組、Mp2組、Mp3組大鼠接小動(dòng)物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣，呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置：潮氣量為40 mL/kg，呼吸頻率為50次/min，吸呼比為1∶1，呼氣末正壓為0，吸入氧濃度為21%。通氣過(guò)程中保持仰臥位，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中維持室溫為26～28 ℃。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 氧合指數(shù)(OI) 于插管即刻(T1)及機(jī)械通氣1、2、4 h(T2～4)時(shí)采集各組大鼠股動(dòng)脈血樣，進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治?，記錄PaO2，計(jì)算OI。OI=PaO2/FiO2。

1.4.2 肺通透指數(shù)(LPI)與肺濕/干重(W/D) T4時(shí)，取各組大鼠股動(dòng)脈血樣2 mL于干燥試管中，4 ℃下3 000 r/min(離心半徑7.7 cm)離心10 min，分離血清，采用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿蛋白濃度。取血后按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求經(jīng)動(dòng)脈放血處死大鼠，立即開(kāi)胸分離兩側(cè)肺組織，結(jié)扎右主支氣管，采用5 mL預(yù)冷的PBS分3次灌洗左肺，回收肺泡支氣管灌洗液，于4 ℃下3 000 r/min離心10 min，離心半徑16 cm，取上清液，-80 ℃保存。采用考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)肺泡支氣管灌洗液中蛋白含量。LPI=支氣管肺泡灌洗液蛋白濃度/血漿蛋白濃度。取左肺下葉稱(chēng)肺濕重，然后置于70 ℃干燥箱中烤至恒重后稱(chēng)干重，計(jì)算W/D。

1.4.3 肺組織病理學(xué)改變及肺泡損傷率(IAR) 取各組大鼠右肺下葉組織，經(jīng)10%中性甲醛固定、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下(×200)觀察肺組織病理學(xué)結(jié)果。光鏡下連續(xù)觀察200個(gè)肺泡，計(jì)數(shù)含紅細(xì)胞和白細(xì)胞超過(guò)2個(gè)以上的肺泡(視為損傷肺泡)數(shù)，計(jì)算IAR，即損傷肺泡計(jì)數(shù)占總肺泡計(jì)數(shù)的百分比。

1.4.4 肺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI) 采用TUNEL法。光鏡下隨機(jī)選取各組大鼠肺泡區(qū)10個(gè)完整而不重疊的高倍視野(×400)，觀察細(xì)胞凋亡情況，計(jì)算AI，AI=凋亡陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.4.5 肺組織JNK mRNA表達(dá) 采用RT-PCR法。取各組大鼠右肺上葉新鮮肺組織100 mg，采用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度法定量后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。采用primer5．0軟件設(shè)計(jì)內(nèi)參β-actin及JNK引物。PCR反應(yīng)條件：95 ℃、10 min，95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35個(gè)循環(huán)后72 ℃、10 min。4 ℃終止反應(yīng)。取PCR反應(yīng)產(chǎn)物10 μL，行瓊脂糖凝膠電泳，采用Imager圖像分析儀測(cè)定各條帶吸光度值，以JNK吸光度值與β-actin吸光度值之比代表JNK mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4.6 JNK、磷酸化JNK(p-JNK)、唯BH3結(jié)構(gòu)域蛋白(BID、BIM、PUMA)、Caspase-3蛋白表達(dá) 采用Western blotting法。取各組大鼠右肺上葉組織，BCA標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定蛋白濃度，采用蛋白抽提試劑提取蛋白。取40 μg蛋白上樣經(jīng)12% SDS-PAGE凝膠電泳后轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜，以兔抗大鼠p-JNK一抗(1∶500)、JNK一抗(1∶500)、BID一抗(1∶2 000)、BIM一抗(1∶2 000)、PUMA一抗(1∶2 000)、Caspase-3一抗(1∶2 000)、β-actin一抗(1∶500)孵育后，4 ℃過(guò)夜。次日洗膜后加入山羊抗兔二抗(1∶500)，室溫孵育1.5 h，再次洗膜后置于NBT/BCIP顯色液避光顯色，掃描蛋白印記圖，采用Imager圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值反應(yīng)目的蛋白表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)OI比較 見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠各時(shí)點(diǎn)OI比較

注：與本組T1時(shí)相比，*P<0.05；與C組同時(shí)點(diǎn)相比，#P<0.05；與V組同時(shí)點(diǎn)相比，△P<0.05。

2.2 各組大鼠肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果及LPI、W/D、IAR、AI比較 光鏡下C組肺組織形態(tài)完整，肺泡形態(tài)正常，肺間質(zhì)未見(jiàn)增厚水腫，肺泡腔無(wú)滲出及出血，罕見(jiàn)中性粒細(xì)胞。V組與Mp1組肺組織結(jié)構(gòu)明顯破壞，肺泡間隔明顯增厚，肺間質(zhì)水腫，肺泡內(nèi)出血，肺泡萎陷，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Mp2、Mp3組較V組病理?yè)p傷減輕，肺泡間隔輕微增厚，肺泡形態(tài)正常，肺泡腔無(wú)明顯滲出及出血，肺間質(zhì)水腫，罕見(jiàn)中性粒細(xì)胞。各組大鼠LPI、W/D、IAR、AI比較見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠LPI、W/D、IAR、AI比較

注：與C組相比，*P<0.05；與V組相比，#P<0.05。

2.3 各組大鼠肺組織JNK、p-JNK蛋白及JNK mRNA表達(dá)比較 見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠肺組織JNK、p-JNK蛋白及JNK mRNA表達(dá)比較

注：與C組相比，*P<0.05；與V組相比，#P<0.05。

2.4 各組大鼠肺組織BID、BIM、PUMA、Caspase-3表達(dá)比較 見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠肺組織BID、BIM、PUMA、Caspase-3表達(dá)比較

注：與C組相比，*P<0.05；與V組相比，#P<0.05。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，大潮氣量機(jī)械通氣4 h時(shí)，與C組比較，V組大鼠OI明顯下降，W/D、LPI、IAR、AI均明顯升高，在光鏡下肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重的病理?yè)p傷，TUNEL法顯示細(xì)胞凋亡明顯增加，表明大鼠機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷模型制備成功。

本研究依據(jù)文獻(xiàn)[7]及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇甲潑尼龍的劑量與用法。本實(shí)驗(yàn)以甲潑尼龍2、10、30 mg/kg作為低、中、高劑量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Mp1組各指標(biāo)與V組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與V組相比，Mp2、3組T3、T4時(shí)OI升高，肺組織W/D、LPI、IAR、AI均降低，肺組織病理學(xué)損傷減輕，細(xì)胞凋亡減少，表明低劑量的甲潑尼龍無(wú)明顯的肺保護(hù)作用，中高劑量的甲潑尼龍具有肺保護(hù)作用。

大潮氣量機(jī)械通氣可對(duì)肺組織細(xì)胞表面產(chǎn)生過(guò)度的機(jī)械牽張，肺組織上皮細(xì)胞受到機(jī)械牽張后可激活JNK通路，誘發(fā)相關(guān)炎性因子的合成與釋放加重肺損傷[8]。有研究[9～11]顯示，糖皮質(zhì)激素可通過(guò)上調(diào)MKP-1表達(dá)來(lái)抑制JNK信號(hào)通路活化，減少相關(guān)炎性因子的表達(dá)，減輕肺損傷。我們的前期研究也同樣發(fā)現(xiàn)，甲潑尼龍可通過(guò)抑制P38MAPK信號(hào)通路活化，減輕大鼠機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷[4]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與V組比較，Mp2、3組大鼠肺組織p-JNK蛋白和JNK mRNA表達(dá)下降，肺損傷減輕，該結(jié)果提示甲潑尼龍減輕大鼠機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷與抑制JNK磷酸化有關(guān)，與既往文獻(xiàn)[9]報(bào)道相符。

JNK磷酸化后可激活BID、BIM、PUMA的促凋亡活性并使其參與線粒體凋亡途徑[12,13]。在線粒體途徑細(xì)胞凋亡過(guò)程中，BID、BIM、PUMA可通過(guò)激活Bax、Bak或者使Bcl-2、Bcl-XL、MCL-1失活，促進(jìn)Bax、Bak形成寡二聚體，從而介導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)，進(jìn)而級(jí)聯(lián)激活Caspase酶[14，15]。Caspase-3是多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)部分，在細(xì)胞凋亡過(guò)程中占據(jù)核心地位，是凋亡的最終執(zhí)行者[16,17]。本研究結(jié)果顯示，與C組比較，V組大鼠肺組織BID、BIM、PUMA、Caspase-3表達(dá)增加，細(xì)胞凋亡顯著，肺損傷較重。提示細(xì)胞凋亡在機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷的發(fā)生中起著重要的作用，該結(jié)果與陳寧等[2]報(bào)道相符。有研究顯示糖皮質(zhì)激素可通過(guò)降低促凋亡因子Bax與凋亡抑制因子Bcl-2的比值，下調(diào)Caspase-3表達(dá)，減少細(xì)胞凋亡，來(lái)減輕大潮氣量機(jī)械通氣導(dǎo)致的大鼠肺損傷[18,19]。本研究結(jié)果顯示，與V組比較，Mp2、3組大鼠肺損傷減輕，同時(shí)伴有BID、BIM、PUMA、Caspase-3表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡減少。該結(jié)果提示甲潑尼龍減輕大鼠機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷與下調(diào)促凋亡因子表達(dá)抑制肺組織細(xì)胞凋亡有關(guān)。

本研究中Mp2與Mp3組的肺保護(hù)作用無(wú)明顯差別，出現(xiàn)該結(jié)果的原因可能是：①大劑量的外源性激素對(duì)大鼠自身激素分泌的負(fù)反饋調(diào)節(jié)；②大鼠在應(yīng)激狀態(tài)下，體內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體的表達(dá)和活性異常，阻礙了糖皮質(zhì)激素生物學(xué)效應(yīng)的發(fā)揮[20]。這提示我們盲目增加激素劑量并不能產(chǎn)生更好的肺保護(hù)效果，中等劑量甲潑尼龍為較合適的肺保護(hù)劑量。

綜上所述，甲潑尼龍預(yù)處理可減輕大鼠機(jī)械通氣相關(guān)性肺損傷，這可能與其抑制肺組織JNK磷酸化，下調(diào)唯BH3結(jié)構(gòu)域促凋亡因子BID、BIM、PUMA表達(dá)，抑制Caspase-3表達(dá)，減少肺組織細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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