杜媛鯤，廖海江，陳閣，張耀中，米源，王雷

(1河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，石家莊 050011；2河北醫(yī)科大學(xué)期刊社)

食管癌主要包括食管鱗狀細(xì)胞癌和食管腺癌，總體發(fā)病率名列全球第八。目前，我國的食管癌發(fā)病率以食管鱗狀細(xì)胞癌為主，但隨著生活水平的提高，食管腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢[1]。手術(shù)和放化療等不能顯著提高中晚期食管腺癌患者5年生存率，因此深入探索食管腺癌發(fā)生發(fā)展的分子學(xué)機(jī)制對于防治患者的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移意義重大。近年研究表明，Hh信號傳導(dǎo)通路的異常激活與肝癌[2]、乳腺癌[3]、基底細(xì)胞癌[4]和急性粒細(xì)胞性白血病[5]的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，在腫瘤細(xì)胞的生長增殖以及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。有研究[6,7]發(fā)現(xiàn)，GANT61作為特異性針對Hh通路核心靶點(diǎn)Gli1和Gli2的抑制劑，在多種腫瘤治療中展示了較好的抗腫瘤活性。本研究使用GANT61特異性下調(diào)人食管腺癌OE33細(xì)胞系Gli(Gli1、Gli2)的表達(dá)，探討Gli表達(dá)和食管腺癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系，以期為食管腺癌的靶向治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料 人食管腺癌細(xì)胞系OE33，RPMI1640培養(yǎng)液，GANT61，Mini-PROTEAN TGX預(yù)制膠，兔抗人Gli1多克隆抗體，鼠抗人Bcl-2單克隆抗體，兔抗人GAPDH單克隆抗體，鼠抗人Gli2單克隆抗體，兔抗人c-myc單克隆抗體，Pierce-BCA蛋白分析試劑盒，小型Trans-Blot?轉(zhuǎn)印槽，Epics-XL型流式細(xì)胞測定儀，M-PER細(xì)胞總蛋白提取試劑。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將食管腺癌OE33細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)傳代所用的培養(yǎng)液為含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI1640。用PBS洗滌生長狀態(tài)良好的OE33細(xì)胞，胰酶消化，收集細(xì)胞并離心，行細(xì)胞計數(shù)后按照3×105/孔細(xì)胞數(shù)鋪于6孔板上，待細(xì)胞培養(yǎng)至70%～80%融合生長狀態(tài)良好時更換為含2%胎牛血清的培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為對照組、實(shí)驗(yàn)一組、實(shí)驗(yàn)二組，分別用0、10、20 μmol/L濃度的GANT61處理24 h。

1.3 細(xì)胞凋亡檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。取上述3組細(xì)胞用PBS液洗滌細(xì)胞3次，胰酶消化，收集細(xì)胞后用70%乙醇固定每組樣本，制備成單細(xì)胞懸液，50 μg/mL PI染液4 ℃染色，冰上避光，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測每組樣本的熒光強(qiáng)度。采用Expo32ADC進(jìn)行每組樣本的免疫熒光數(shù)據(jù)分析，計算每組樣本細(xì)胞的凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 各組細(xì)胞Gli1、Gli2、c-myc、Bcl-2蛋白檢測 采用Western blotting法。用PBS沖洗上述3組細(xì)胞后，每孔加M-PER培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白提取試劑100 μL，用刮匙收集每組樣本細(xì)胞的總蛋白提取液，BCA法測定每組樣本細(xì)胞的總蛋白濃度。在Mini-PROTEAN TGX預(yù)制膠中以每道10 μg蛋白上樣，在200 V、40 min的反應(yīng)條件下經(jīng)Tris/甘氨酸/電泳緩沖液SDS進(jìn)行電泳。100 V、40 min實(shí)驗(yàn)條件下冰水浴將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。TBST液洗膜3次，每次10 min，再用5%脫脂奶粉/TBST液封閉PVDF膜1 h后加一抗工作液，工作濃度Gli1為1∶1 000，Gli2為1∶250，Bcl-2為1∶1 000，c-myc為1∶1 000，GAPDH為1∶40 000，4 ℃過夜。第2天更換二抗前后各用TBST洗膜3次，每次10 min，二抗羊抗兔或羊抗鼠工作濃度均為1∶10 000，室溫孵育1 h。于膜上加ECL試劑顯色5 min后于暗室X線曝光顯影，顯影條帶用Image軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡率比較 實(shí)驗(yàn)一組、實(shí)驗(yàn)二組、對照組細(xì)胞凋亡率分別為16.12%±1.52%、25.62%±0.93%、2.74%±0.34%，兩兩相比P均<0.01。

2.2 各組細(xì)胞Gli1、Gli2、c-myc、Bcl-2蛋白表達(dá)比較 見表1。

表1 各組細(xì)胞Gli1、Gli2、c-myc、Bcl-2蛋白表達(dá)比較

注：與對照組相比，*P<0.01；與實(shí)驗(yàn)一組相比，#P<0.01。

3 討論

腫瘤的發(fā)生和發(fā)展包括細(xì)胞的異常增殖和凋亡受抑制，深入研究細(xì)胞凋亡的機(jī)制和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡具有重要的臨床價值和理論意義。Hh信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路由上游Shh配體、PTCH和Smo組成的受體復(fù)合物、下游核轉(zhuǎn)錄因子Gli蛋白家族以及多種靶基因等構(gòu)成，從而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。Hh信號通路可在多個點(diǎn)位上發(fā)生突變并最終形成腫瘤，其中Gli是Hh信號通路的核轉(zhuǎn)錄子，位于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的樞紐位置，發(fā)揮著Hh通路調(diào)節(jié)器的作用。研究[8,9]表明，Gli1和Gli2表達(dá)上調(diào)代表Hh信號通路的激活，在細(xì)胞的自我更新和凋亡過程中發(fā)揮重要作用；并且有研究[10]發(fā)現(xiàn)，針對Gli靶點(diǎn)進(jìn)行調(diào)控比針對上游靶點(diǎn)Smo具有更強(qiáng)的抗腫瘤作用，可以顯著抑制胸膜間皮瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移。因此，本實(shí)驗(yàn)通過體外研究探討Gli對食管腺癌OE33細(xì)胞凋亡的影響及其可能的相關(guān)機(jī)制。

腫瘤細(xì)胞的凋亡是由細(xì)胞內(nèi)多基因精確調(diào)控的過程，當(dāng)細(xì)胞凋亡調(diào)控紊亂時可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。Bcl-2基因是細(xì)胞線粒體膜滲透性改變的內(nèi)源性抑制物，能夠抑制多條凋亡信號并延長細(xì)胞壽命，與多種人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)；并且有研究[11]表明，Bcl-2是Gli1和Gli2直接的轉(zhuǎn)錄靶基因。c-myc在多種腫瘤組織中高表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中與細(xì)胞周期變化、細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化和分化以及細(xì)胞凋亡過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，靶向抑制c-myc可誘導(dǎo)某些腫瘤細(xì)胞凋亡和抑制增殖[12,13]。本研究結(jié)果顯示，隨著GANT61藥物濃度的增高其誘導(dǎo)食管腺癌細(xì)胞凋亡的能力顯著增加。本研究進(jìn)一步從蛋白水平探討了食管腺癌OE33細(xì)胞Gli表達(dá)和細(xì)胞凋亡與增殖的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GANT61不但可以呈劑量依賴性顯著下調(diào)OE33細(xì)胞的Gli1和Gli2蛋白表達(dá)，并且可以顯著下調(diào)Bcl-2和c-myc蛋白表達(dá)。分析其原因可能是，在食管腺癌組織中存在Hh/Gli通路異常激活的狀態(tài)，參與調(diào)控OE33細(xì)胞增殖與凋亡過程，GANT61可靶向特異性抑制Gli1和Gli2表達(dá)來調(diào)控下游靶基因Bcl-2的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞凋亡，同時通過調(diào)節(jié)c-myc蛋白對腫瘤細(xì)胞的生長進(jìn)行調(diào)控，最終達(dá)到抗腫瘤的目的。這與Fu等[14]研究發(fā)現(xiàn)GANT61可以通過增加TRAIL-R1/DR4、TRAIL-R2/DR5和Fas表達(dá)，下調(diào)Bcl-2、c-myc等表達(dá)抑制胰腺癌干細(xì)胞生長的研究結(jié)果相一致。表明Bcl-2和c-myc在食管腺癌發(fā)生中可能具有協(xié)同作用，在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的同時又促進(jìn)細(xì)胞增殖，GANT61可有效降低這兩種蛋白的陽性表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。

綜上可見，Gli抑制劑GANT61對食管腺癌OE33細(xì)胞凋亡具有誘導(dǎo)作用，GANT61可能是通過特異性抑制Gli1、Gli2蛋白表達(dá)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞中Bcl-2和c-myc蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長，這為GANT61治療食管癌的應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。

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