張夢梅，唐妍，王元艷，柏杰，楊澤，柏玉舉

(1遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤醫(yī)院，貴州遵義563000；2遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū))

肺癌為全球病死率最高、發(fā)病率第二的惡性腫瘤[1,2]，其中絕大多數(shù)肺癌類型為非小細(xì)胞肺癌。目前，含鉑兩藥聯(lián)合方案化療仍然是非小細(xì)胞肺癌的主要治療手段之一，但療效欠佳，且不良反應(yīng)嚴(yán)重[3,4]。鉑類化療藥物耐藥大大降低了化療的療效。然而，鉑類耐藥的機制尚未完全闡明[5]。順鉑是鉑類中最具代表性的化療藥物之一，因此，研究順鉑耐藥的機制，尋找調(diào)控耐藥的基因，有助于研發(fā)化療增敏劑及在臨床上篩選對鉑類化療敏感的患者，實現(xiàn)精準(zhǔn)醫(yī)療；也有助于研發(fā)新的更為有效的鉑類化療藥物，提高化療療效。近年來，隨著人類基因組測序工程的完成，在大數(shù)據(jù)的時代背景下，基因芯片廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)的研究[6,7]。而基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(GEO)則是承載這些基因芯片數(shù)據(jù)的全球最重要的數(shù)據(jù)庫之一。2017年7～12月，本課題組通過檢索GEO，提取非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞株順鉑耐藥的微陣列芯片數(shù)據(jù)，使用生物信息學(xué)方法對芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，預(yù)測其相關(guān)的靶基因及信號傳導(dǎo)通路，獲得新的相關(guān)差異基因及信號傳導(dǎo)通路，為后續(xù)的臨床和實驗研究奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 基因芯片數(shù)據(jù)收集 基因芯片數(shù)據(jù)來自于GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)。以“Cisplatin-resistant”“non-small cell lung cancer”為檢索詞在數(shù)據(jù)庫中查詢到ID為5247，芯片數(shù)據(jù)編號為GSE21656。其中，GSM540420、GSM540421、GSM540422分別為親代H460細(xì)胞株樣本(親本組)，GSM540423、GSM540424、GSM540425分別為順鉑耐藥抗拒細(xì)胞株樣本(耐藥組)。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理 下載芯片數(shù)據(jù)的全部文件，使用UltraEdit 21.20.0.1001數(shù)據(jù)編輯軟件打開文件，復(fù)制基因名稱信息，樣本編號及數(shù)值到Microsoft Office Excel 2013表格(Excel表格單元格格式選擇文本格式)中。使用Excel表格對數(shù)據(jù)進(jìn)行排序并刪除數(shù)據(jù)不全的探針數(shù)據(jù)。將全部數(shù)據(jù)從Excel中輸出為“input.txt”格式文本。

1.3 差異表達(dá)基因分析 使用R統(tǒng)計語言中的“l(fā)imma”以及“impute”包，對獲取的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，相同基因不同探針數(shù)據(jù)取均值。原始實驗數(shù)據(jù)分別使用“normexp”和“quantile”方法進(jìn)行背景校正和標(biāo)準(zhǔn)化處理。以|差異倍數(shù)|≥2且校正后P≤0.05設(shè)定檢驗標(biāo)準(zhǔn)，使用R軟件進(jìn)行貝葉斯顯著性檢驗。|差異倍數(shù)|≥2且校正后P≤0.05的探針被認(rèn)為具有顯著性表達(dá)差異。得到差異表達(dá)的基因，并輸出為表格，繪制火山圖。

1.4 差異表達(dá)基因的功能、所富集的信號通路分析 通過DAVID v6.8(https://david.ncifcrf.gov/)及Pathway(http://www.pantherdb.org/)在線軟件對差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，進(jìn)一步分析其生物學(xué)功能及信號傳導(dǎo)通路。Pathway在線分析軟件分別從生物學(xué)過程、細(xì)胞組分分析、分子功能分析、信號傳導(dǎo)通路分析四個角度，分析顯著差異表達(dá)的基因的功能。并使用基因本體論(GO)對差異表達(dá)基因的功能進(jìn)行分類。同時檢索PubMed，研究所富集的信號通路有無相關(guān)文獻(xiàn)報道。

2 結(jié)果

2.1 兩組表達(dá)顯著差異的基因 H460細(xì)胞耐藥組和親本組基因的表達(dá)水平存在差異。其中34個基因在耐藥組中差異表達(dá)，表達(dá)水平顯著上調(diào)有7個，顯著下調(diào)有27個(表1)。分級聚類分析火山圖初步顯示差異基因的表達(dá)，見圖1。

2.2 兩組顯著差異表達(dá)基因的功能 34個差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本在GO注釋中顯著富集(圖2)。表達(dá)上調(diào)的轉(zhuǎn)錄本分別在GO:0035025 Rho蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控(BP)、GO:0030336細(xì)胞遷移的負(fù)性調(diào)節(jié)(BP)、GO:0001501骨骼系統(tǒng)的發(fā)育(BP)、GO:0007507心臟發(fā)育(BP)中顯著富集；而表達(dá)下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本則在GO:0007155細(xì)胞黏附(BP)、GO:0009986細(xì)胞膜(CC)、GO:0043679軸突末端(CC)、GO:0016021膜的整體成分(CC)、GO:0007165信號傳導(dǎo)(BP)中顯著富集。這些差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本多與肌動蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞功能調(diào)控以及膜的組成相關(guān)。

2.3 兩組差異表達(dá)基因所富集的信號通路 采用DAVID在線軟件分析顯示，兩組差異表達(dá)上調(diào)的基因主要在8條通路中富集，下調(diào)基因主要在15條通路中富集，相關(guān)文獻(xiàn)報道情況總結(jié)于表2。Pathway在線分析軟件顯示，兩組差異表達(dá)的基因在16條通路中顯著富集，目前與鉑類耐藥相關(guān)的研究情況總結(jié)于表3。

3 討論

目前，依據(jù)《中國臨床腫瘤學(xué)會(CSCO)原發(fā)性肺癌診療指南2016.V1》以及最新NCCN指南，化療依然是非小細(xì)胞肺癌治療的主要手段之一。標(biāo)準(zhǔn)的一線治療方案為含鉑兩藥聯(lián)合，但有效率僅為25%～30%，隨著化療次數(shù)增加，耐藥性逐漸顯現(xiàn)。鑒于化療產(chǎn)生的不良反應(yīng)及易耐藥性，尋找順鉑耐藥基因，預(yù)測順鉑的化療效果，指導(dǎo)個體化用藥，針對耐藥基因研發(fā)靶向抑制藥物，逆轉(zhuǎn)鉑類耐藥，在腫瘤的治療中具有重大意義。

表1 兩組表達(dá)顯著差異的基因

注：差異倍數(shù)2以上的點表示顯著上調(diào)的基因；-2以下的點表示顯著下調(diào)的基因。

圖1差異基因火山圖

“后基因組時代”的到來，使得基因芯片在現(xiàn)代生命科學(xué)研究中具有非常重要的作用[8]。GEO就是一個全球集成的高通量芯片表達(dá)譜數(shù)據(jù)庫，用于儲存、處理、整合全球多組數(shù)據(jù)，以便檢索、分析及下載，作為信息數(shù)據(jù)集中和發(fā)布的樞紐，是傳統(tǒng)實驗室數(shù)據(jù)資源的有效補充。既往實驗研究多在提出問題后，從單個基因及通路入手尋找研究的突破點，一方面研究盲目性較高，另一方面易忽視多個基因及多個通路之間的相互作用，而使研究偏離問題的中心。目前，尚沒有相關(guān)生物信息學(xué)分析非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥機制的研究報道。本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫已發(fā)表的順鉑耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株芯片，處理數(shù)據(jù)，并分析其調(diào)控基因及信號通路，為尋找順鉑耐藥基因提供了新的有效方法，初步揭示了非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥的機制。

圖2 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

表2 兩組差異表達(dá)基因所富集的信號通路(DAVID在線軟件分析)及其文獻(xiàn)報道情況

分析發(fā)現(xiàn)，順鉑耐藥H460細(xì)胞株中，部分基因表達(dá)水平發(fā)生了改變。差異分析顯示IGFBP3蛋白在順鉑耐藥機制中起重要作用，這在后續(xù)的實驗研究中得到了證實[9]。為了對H460細(xì)胞順鉑耐藥差異表達(dá)的基因有更加深入的了解，本研究對相關(guān)的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行GO分析和通路富集分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表達(dá)具有差異的轉(zhuǎn)錄本多與肌動蛋白細(xì)胞骨架、細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞功能調(diào)控以及膜的組成相關(guān)，這說明細(xì)胞功能的改變是H460細(xì)胞順鉑耐藥發(fā)生過程的重要組成部分。DAVID及Pathway在線軟件進(jìn)行信號傳導(dǎo)通路分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因在黏著斑通路、血管內(nèi)皮生長因子信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶B信號通路、p53基因信號通路等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集[10～25]，這與GO分析結(jié)果相吻合，這也在已報道的非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥研究的相關(guān)文獻(xiàn)[26,27]中得到了證實。

表3 兩組差異表達(dá)基因所富集的信號通路(Pathway在線軟件分析)及其文獻(xiàn)報道情況

本研究還發(fā)現(xiàn),在順鉑耐藥中尚有其他信號通路參與，比如癌癥轉(zhuǎn)錄失控、血小板活化通路、蛋白質(zhì)消化吸收、血管生成、CAMs、軸突導(dǎo)向信號等。它們是否在非小細(xì)胞肺癌對順鉑耐藥的發(fā)生中發(fā)揮重要調(diào)控作用尚需更進(jìn)一步的研究證實，這為后續(xù)相關(guān)研究提供了研究方向。

本研究找出了非小細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞順鉑耐藥相關(guān)的差異表達(dá)基因，總結(jié)并分析了差異表達(dá)基因所富集的腫瘤相關(guān)通路，為更進(jìn)一步研究非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥的機制提供了重要思路和依據(jù)。

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