張書鋒，劉翠華，劉鈞菲，李玉柳，厲洪江

(鄭州大學附屬兒童醫(yī)院/河南省兒童醫(yī)院/鄭州兒童醫(yī)院腎臟風濕科 450018)

難治性腎病綜合征(refractory nephritic syndrome，RNS)是原發(fā)性腎病綜合征的一種特殊類型，環(huán)磷酰胺是目前西醫(yī)治療RNS的首選方案之一，然而該療法整體療效較低、不良反應(yīng)較大，且復發(fā)率較高，故難達到預期效果[1]。文獻[2]報道他克莫司較環(huán)磷酰胺能提高RNS患兒的緩解率，治療6個月時患兒的總緩解率顯著提高，他克莫司治療RNS的有效性優(yōu)于環(huán)磷酰胺。越來越多的研究顯示，中醫(yī)藥可改善RNS患兒的臨床癥狀，減輕藥物不良反應(yīng)及延緩腎衰竭等作用[3]。在西醫(yī)基礎(chǔ)上應(yīng)用中藥干預可顯著改善患兒的癥狀體征，提高臨床療效，且能夠減少單純西藥所致的不良反應(yīng)[4]。保真湯為《證治準繩》古方，具有脾腎雙補、補氣益陰、利濕退熱等作用，既往研究報道保真湯治療腎病綜合征能夠改善患兒的蛋白尿和浮腫癥狀，增加血清蛋白水平[5]。本組研究經(jīng)悉心辨證納入RNS脾腎陽虛證患兒，旨在進一步評估他克莫司聯(lián)合保真湯加減的中西醫(yī)結(jié)合優(yōu)化治療方案的有效性和安全性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇2014年7月至2016年12月在本院就診的RNS患兒104例，分為對照組(52例)和治療組(52例)，期間對照組轉(zhuǎn)院2例和資料遺失1例共完成研究49例，治療組查出腫瘤1例和中途退出1例共完成50例。對照組(49例)：男29例，女20例；年齡5～13歲，平均(9.2±1.5)歲；病程1.0～2.3年，平均(1.3±0.2)年；初診24 h尿蛋白3.5～17.9 g，平均6.9 g；血清清蛋白18.95～34.06 g/L，平均26.88 g/L；伴高血壓者7例；病理類型：微小病變腎病8例，局灶節(jié)段性腎小球硬化癥12例，膜性腎病10例，膜增生性腎小球腎炎4例，系膜增生性腎炎15例。治療組(50例)：男31例，女19例；年齡4～14歲，平均(9.3±1.5)歲；病程1.2～2.4年，平均(1.3±0.2)年；初診24 h尿蛋白3.4～18.2 g，平均6.9 g；血清清蛋白18.98～33.97 g/L，平均26.76 g/L；伴高血壓者9例；病理類型：微小病變腎病9例，局灶節(jié)段性腎小球硬化癥10例，膜性腎病11例，膜增生性腎小球腎炎3例，系膜增生性腎炎17例。兩組一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會批準通過(20140312)。

1.2診斷標準

1.2.1RNS診斷標準 依據(jù)全球腎臟病預后生存質(zhì)量(KDIGO)指南[6]?；純撼跏技に馗深A有效但復發(fā)后再次治療無效，或標準劑量(1 mg·kg-1·d-1)激素干預8～12周后無改善效果；腎小球濾過率大于或等于60 mL·min-1·1.73 m-2。

1.2.2脾腎陽虛證診斷標準 根據(jù)《中醫(yī)內(nèi)科常見病診療指南西醫(yī)疾病部分》[7]。主癥：面色白光白，遍體浮腫，形寒肢冷，甚則并發(fā)腹水、胸水，胸悶，大便溏薄，小便短少，舌淡體胖，苔薄膩或白膩，脈沉細滑。

1.3納入標準 (1)符合難治性腎病綜合征診斷患兒；(2)符合中醫(yī)脾腎陽虛證診斷患兒；(3)年齡5～15歲；(4)近期未服用中藥患兒；(5)患兒家屬簽署知情同意書。

1.4排除標準 (1)過敏體質(zhì)患兒；(2)依從性差患兒；(3)繼發(fā)性腎病綜合征患兒；(4)伴心、肺、肝及造血系統(tǒng)等嚴重疾病患兒。

1.5治療方法 基礎(chǔ)治療：采用優(yōu)質(zhì)限蛋白、低脂、低鹽飲食，并根據(jù)病情予以控制血壓、抗凝、利尿、維持水電解質(zhì)平衡及抗感染等對癥干預，對于血清清蛋白低于20 g/L者加用低分子肝素。對照組采用環(huán)磷酰胺(山西普德藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H20093032)治療，10 mg·kg-1·d-1，用0.9%生理鹽水100 mL稀釋后靜脈滴注，2次/周，累計劑量小于150 mg/kg。治療組采取他克莫司(stellas Ireland Co.,Ltd，國藥準字J20090142A)治療，初始劑量為0.05～0.10 mg·kg-1·d-1，血藥濃度維持在5～10 ng/mL；保真湯加減治療，中藥組成：附子9 g，干姜15 g，黃芪15 g，白術(shù)12 g，甘草9 g，茯苓12 g，當歸10 g，生地12 g，黨參15 g，芡實10 g，山藥12 g，白芍9 g，石葦9 g，黃柏10 g，蓮子肉12 g，薏苡仁10 g，大薊10 g，澤瀉12 g；每天1劑，水煎服，每天2次。療程：兩組連續(xù)治療3個月。

1.6觀察指標 (1)應(yīng)用生化分析儀于治療前后測定血漿清蛋白、24 h尿蛋白定量、三酰甘油及總膽固醇水平；(2)癥狀評分。依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導原則》[8]擬定。對面色白光白、浮腫、形寒肢冷、腹水、胸水及大便溏薄按癥狀分級評分：正常(0分)、輕度(1分)、中度(2分)及重度(4分)，于治療前后評定；(3)不良反應(yīng)。觀察療程中兩組不良反應(yīng)發(fā)生情況，比較發(fā)生率；(4)兩組TLR 7mRNA檢測。采取實時熒光定量PCR法測定外周血TLR7 mRNA，抽取靜脈血4 mL，置于肝素抗凝管，應(yīng)用TRIzol試劑提取總RNA，嚴格按試劑說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?；TLR7引物：上游5′-TCT TCA ACC AGA CCT CTA CAT TCC-3′，下游5 ′-GGA ACA TCC AGA GTG ACA TCA CA-3′，擴增片段長度為110 bp；β-actin：上游5′-CCG CCA TGT AGG TCG CTA T-3′，下游5′-TGA CAC GCC ATC ACC AG-3′；PCR采取25 μL 反應(yīng)體系，其中上下游各1.00 μL、Taq 酶0.35 μL、熒光染料0.55 μL、cDNA 1.50 μL、dNTPs 1.50 μL；擴增條件：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性20 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)；TLR 7mRNA值為目的基因與內(nèi)參照基因的比值；(5)兩組血清中核因子(NF)-κB、腫瘤壞死因子(TNF)-α和白細胞介素(IL)-6水平。采取酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)于治療前后測定。

1.7療效標準 依據(jù)《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》[8]評定。痊愈：血清蛋白大于或等于35 g/L，尿蛋白定量持續(xù)小于或等于0.2 g/24 h，癥狀評分降低大于或等于90%，三酰甘油和血總膽固醇基本正常。顯效：血清蛋白在30～35 g/L，尿蛋白定量小于1 g/24 h，癥狀評分下降大于或等于60%。改善：血清蛋白有所好轉(zhuǎn)，尿蛋白定量小于3 g/24 h，癥狀積分下降大于或等于30%。無效：尿蛋白、血清蛋白未見顯著好轉(zhuǎn)，癥狀積分下降小于30%?？傆行?(臨床痊愈+顯效+改善)例數(shù)/總例數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1兩組血漿清蛋白、24 h尿蛋白定量、三酰甘油和總膽固醇水平比較 兩組治療后血漿清蛋白水平顯著提高，24 h尿蛋白定量、三酰甘油、總膽固醇水平明顯下降(P<0.01)。治療組治療后血漿清蛋白水平明顯高于對照組，24 h尿蛋白定量、三酰甘油、總膽固醇水平明顯少于對照組(P<0.01)，見表1。

表1 兩組血漿清蛋白、24 h尿蛋白定量、三酰甘油總膽固醇水平比較

*：P<0.01，與本組治療前比較；#：P<0.01，與對照組治療后比較

表2 兩組癥狀評分比較分)

*：P<0.01，與本組治療前比較；#：P<0.01，與對照組治療后比較

2.2兩組癥狀評分比較 兩組治療后面色白光白等癥狀評分均明顯減少(P<0.01)。治療組治療后面色白光白等癥狀評分明顯少于對照組(P<0.01)，見表2。

2.3兩組療效比較 治療組總有效率為94.00%明顯優(yōu)于對照組的77.55%(P<0.05)，見表3。

表3 兩組療效比較

*：P<0.01與治療組比較

2.4兩組不良反應(yīng)發(fā)生比較 治療組不良反應(yīng)發(fā)生率16.00%，明顯低于對照組的40.82%(P<0.05)，見表4。

表4 兩組不良反應(yīng)發(fā)生比較

*：P<0.05，與治療組比較

2.5兩組TLR7 mRNA和血清NF-κB、TNF-α、IL-6水平比較 治療后兩組TLR7 mRNA和血清NF-κB、TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.01)。治療組治療后TLR7 mRNA和血清NF-κB、TNF-α、IL-6水平顯著少于對照組(P<0.01),見表5。

表5 兩組TLR 7mRNA和血清NF-κB、TNF-α、IL-6水平比較

*：P<0.01，與本組治療前比較；#：P<0.01，與對照組治療后比較

3 討 論

環(huán)磷酰胺是RNS的一線經(jīng)典藥物治療方案，被廣泛應(yīng)用于臨床治療和隨機對照試驗研究。而他克莫司可替代環(huán)磷酰胺，且用于RNS患兒有效性高于環(huán)磷酰胺[2]。文獻[9]報道他克莫司對RNS的短期療效好，但隨著時間延長他克莫司會出現(xiàn)藥物療效下降和伴嚴重不良反應(yīng)，患兒的耐受性明顯降低。因此，針對RNS的治療，如何解決上述問題，本研究將中藥復方聯(lián)合他克莫司與環(huán)磷酰胺對比，可以獲得較代表性的數(shù)據(jù)。

RNS屬中醫(yī)學“虛損”“尿濁”等范疇。關(guān)于RNS的病機雖眾說紛紜，然而脈證相參，分析其病理，脾腎兩虛、濕濁潴留是該病基本病理。蓋脾主運化，作用于精微的攝取與水液的輸布；腎司開闔，作用于精氣的藏蓄與濕濁的排泄。《病機沙篆》記載：“夫人之虛…而獨舉脾腎者，水為天一之元，土為萬物之母，二臟安和，諸經(jīng)各治”?！端貑枴ぶ琳嬉笳摗吩唬骸爸T濕腫滿，皆屬于脾”。《水熱穴論》亦云：“腎者，胃之關(guān)也，關(guān)門不利，故聚也而從其類也”。太陰虛則運化無權(quán)，難以攝取精微，又難以輸布水液；少陰虛則開闔失常，未能固攝精氣，又未能排泄?jié)駶?。清不升而濁不降，漸致血清清蛋白偏低、膽固醇反高，尿蛋白大量喪失。因知RNS的浮腫乏力等癥，確與脾腎同病、濕濁中困有關(guān)。然“無陰則陽無以化，無陽則陰無以生”，且濕濁易從熱化。故治法宜以脾腎虛損為要，氣陰兼顧，濕熱兩清。

保真湯出自《證治準繩》，基于RNS病理的正確認識和前期研究而提出來的，并根據(jù)脾腎陽虛證進行了加減應(yīng)用。方中附子溫腎助陽兼暖脾土，附子善溫腎陽而助氣化以行水，干姜偏于溫脾陽助運化以制水；黨參、黃芪、白術(shù)、茯苓補氣健脾，茯苓利水滲濕使水邪從小便去，白術(shù)健脾燥濕以促進脾陽健運；白芍防附子燥熱傷陰，利于久服緩治；當歸、生地滋陰補血；蓮子肉、芡實、山藥平補脾腎；薏苡仁、石葦、大薊、黃柏、澤瀉清化濕熱；甘草益氣健脾、協(xié)調(diào)全方；該方脾腎雙補，補氣益陰，利濕退熱，切中本病病理。

本研究結(jié)果顯示，作為中藥復方保真湯聯(lián)合他克莫司治療RNS脾腎陽虛證，在改善臨床癥狀體征(面色白光白、浮腫、形寒肢冷、腹水、胸水及大便溏薄)、提高血漿清蛋白和降低24 h尿蛋白定量、三酰甘油、總膽固醇水平方面均優(yōu)于對照組的強的松聯(lián)合環(huán)磷酰胺方案；治療3個月后，對照組的總有效率為94.00%，也明顯高于對照組的77.55%；同時，治療組不良反應(yīng)更小，患兒依從性良好。因此，中藥復方保真湯加減聯(lián)合經(jīng)典西藥是治療RNS的有效方案。

濕濁潴留是腎病綜合征的基本病理，水濕也可進一步傷陽、化熱，使?jié)駸嵝纬?，推動疾病發(fā)展的主要病理環(huán)節(jié)，水濕郁久必生濕熱，或腎病日久，陽損及陰，使真陰虧虛，虛熱內(nèi)生，熱與濕互結(jié)而成濕熱，濕熱不僅是腎病綜合征的重要病因，也是引起腎病綜合征復發(fā)、加重及難治的主因[10]。研究發(fā)現(xiàn)，濕熱因素干預可上調(diào)TLR-7介導信號因子，尤其是下游信號因子NF-κB，通過激發(fā)Toll-7-NF-κB信號通路加重濕熱致病程度[11]。文獻[12-13]報道稱TLR7通過髓樣分化因子/NF-κB通路進行信號轉(zhuǎn)導，提高促炎細胞因子如TNF-α和IL-6表達，啟動適應(yīng)性免疫應(yīng)答，參與許多腎臟疾病的形成，免疫組織化學法也顯示TLR7在腎病綜合征患兒的腎組織中表達明顯增多，且其表達程度與腎病綜合征的病理類型相關(guān)。其他研究發(fā)現(xiàn)，TLR7-NF-κB通路激活可上調(diào)TNF-α和IL-6的表達，這些炎性因子可促進腎組織的炎癥和損傷，加重RNS病理過程[14-16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，治療組治療后TLR 7mRNA和血清NF-κB、TNF-α、IL-6水平顯著少于對照組(P<0.01)。說明他克莫司聯(lián)合保真湯加減可能通過抑制TLR7-NF-κB通路，下調(diào) TNF-α和IL-6水平，達到治療效果。

他克莫司聯(lián)合保真湯加減治療RNS脾腎陽虛證有效、安全，治療方案可通過改變上述通路及其細胞因子水平而發(fā)揮作用。本研究不足之處在于：試驗設(shè)計缺乏陽性藥物對照組，沒有運用分子生物學等方法探究上述通路在RNS中的作用及本治療方案的效果，此外本研究納入的病例量相對較小，對結(jié)果可能產(chǎn)生一定偏倚。因此，隨機、對照、雙盲、多中心的臨床試驗來評價他克莫司聯(lián)合保真湯加減的療效和安全性十分必要。

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