王 勇,郭永連,陳 琳,李國灝,余家俊,程 薇

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬武漢市中心醫(yī)院泌尿外科，武漢 430014；2.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院，武漢 430077 )

腎細(xì)胞癌簡稱腎癌，2015年美國癌癥協(xié)會的調(diào)查顯示，腎癌新發(fā)病例61 560例，死亡病例14 080例[1]。腎癌對化療和放療均不敏感，首選治療方案依然是手術(shù)切除。然而仍有很多腎癌患者的預(yù)后并不理想[2]，尋找一種有效的靶基因治療一直是腎癌研究的熱點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞周期調(diào)控的異常導(dǎo)致其增殖能力增強(qiáng)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。p2l是目前已知的具有最廣泛細(xì)胞周期依賴性激酶抑制活性的蛋白，廣泛參與細(xì)胞增殖、分化、衰老、凋亡等多種細(xì)胞功能的變化[3]。研究表明腎癌組織中p21蛋白的表達(dá)明顯下調(diào)，且p21蛋白表達(dá)水平與患者的預(yù)后密切相關(guān)[4]。微小RNA(miR-1180)是新近發(fā)現(xiàn)的具有激活p21蛋白表達(dá)的小分子非編碼RNA[5]。本研究旨在研究miR-1180能否激活腎癌細(xì)胞中p21基因的表達(dá)，并觀察其對腎癌細(xì)胞生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1材料 胎牛血清、DMEM和RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；人腎癌細(xì)胞系786-O和ACHN購于中國科學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所；Lipofectamine 2000、SuperScript reverse transcriptase和超敏增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑盒購于美國Invitrogen公司； dsControl[6](一組已知的缺少人類基因重要同源性的dsRNA，反義鏈:5′-UCU ACU GUC ACU CAG UAG U-3′)和miR-1180 mimics(5′-GGA CCC ACC CGG CCG GGA AUA-3′)購于廣州銳博生物科技有限公司，miR-1180與p21基因啟動子序列特異性結(jié)合(圖1)； StepOne PlusTM Real-Time PCR System購于美國ABI公司；熒光定量PCR試劑盒購于日本TaKaRa公司；PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；一抗β-actin、p21、CDK4、CDK6和CyclinD1購于美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔/鼠二抗購于美國Affinity公司。BCA protein assay kit購于美國Pierce公司；MTS試劑盒購于美國Sigma公司。

圖1 miR-1180序列及其特異性結(jié)合的人p21基因啟動子轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游序列

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 在37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人腎癌細(xì)胞系A(chǔ)CHN，使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)786-O。轉(zhuǎn)染前12 h取對數(shù)生長期的腎癌細(xì)胞接種于新的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待腎癌細(xì)胞融合度為40%～60%進(jìn)行轉(zhuǎn)染，使用Lipofectamine 2000作為轉(zhuǎn)染試劑。6 h后觀察細(xì)胞狀態(tài)并更換培養(yǎng)基。

1.2.3總RNA的提取和qRT-PCR檢測p21 mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染后72 h收集細(xì)胞，提取總RNA。使用SuperScript reverse transcriptasex反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參，合成的cDNA使用熒光定量(qRt)PCR試劑盒及相應(yīng)引物通過PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測，結(jié)果采用2-ΔΔCt方法分析。GAPDH引物序列：上游 5′-TCC CAT CAC CAT CTT CCA-3′，下游5′-CAT CAC GCC ACA GTT TCC-3′。p2l引物：上游5′ -GCC CAG TGG ACA GCG AGC AG-3′;下游5′ -GCC GGC GTT TGG AGT GGT AGA-3′ 。

1.2.4總蛋白的提取和Western blot分析 轉(zhuǎn)染72 h后收集腎癌細(xì)胞用于p21蛋白表達(dá)的分析。用PBS洗3次，加入含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液，4 ℃裂解30 min，高速離心20 min，提取總蛋白。使用BCA protein assay kit進(jìn)行蛋白濃度測定。將每個樣本提取的蛋白上樣30 μg蛋白至SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳， 使用NC膜轉(zhuǎn)膜后用含5%牛血清清蛋白的TBST溶液室溫封閉1 h后，分別與一抗β-actin(1∶2 000稀釋)、p21(1∶1 000稀釋)、CDK4(1∶3 000稀釋)、CDK6(1∶2 000稀釋)和CyclinD1(1∶1 000稀釋)在4 ℃下孵育過夜。 24 h后使用羊抗兔/鼠二抗(1∶3 000稀釋)室溫下孵育1 h，ECL試劑曝光顯影，觀察免疫反應(yīng)的條帶。

1.2.5流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布 轉(zhuǎn)染72 h后消化收集細(xì)胞，PBS溶液洗2次；70%乙醇固定，置4 ℃冰箱過夜；24 h后PBS溶液洗2次；使用100 μLRNAse在 37 ℃水浴箱孵育；30 min后加入100 μL PI 混勻，置于4 ℃冰箱避光孵育30 min；使用流式細(xì)胞儀分析記錄激發(fā)波長在488 nm處的紅色熒光。

1.2.6多靶掃描法(MTS)細(xì)胞分析轉(zhuǎn)染后腎癌細(xì)胞活力 每組設(shè)4個復(fù)孔，每孔內(nèi)接種3 000個細(xì)胞，在96孔板邊緣每孔內(nèi)加入200 μL PBS溶液減少蒸發(fā)，轉(zhuǎn)染后于第1、2、3、4、5天分別利用MTS試劑盒分析細(xì)胞活力。在每個時間點(diǎn)，從培養(yǎng)箱內(nèi)取出待檢測的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，棄上清液；避光加入約110 μL MTS稀釋液(100 μL 細(xì)胞培養(yǎng)基和10 μL MTS試劑混勻)，放回37 ℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱孵育1～2 h；分析前清除氣泡，酶標(biāo)儀分析每孔在490 nm波長的吸光度(A)值，存儲數(shù)據(jù)。檢測完畢后將96孔細(xì)胞培養(yǎng)板放回培養(yǎng)箱。

1.2.7集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)分析轉(zhuǎn)染后細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染后24 h，胰酶消化收集細(xì)胞，按1 000個/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，持續(xù)培養(yǎng)10余天；棄上清液，PBS溶液洗2次；加入1 mL甲醇固定15～20 min；棄去甲醇，使用0.1%結(jié)晶紫溶液固定約30 min；流水緩慢洗去殘余結(jié)晶紫染液，室溫晾干、拍照、存儲。

2 結(jié) 果

2.1qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞p21 mRNA的表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-1180后，786-O和ACHN細(xì)胞中p21 mRNA的表達(dá)較dsControl組分別上調(diào)2.54倍(P<0.01)和2.49倍(P<0.01)(圖2)。

A：786-O細(xì)胞；B：ACHN細(xì)胞；*：P<0.01，與dsControl組比較

圖2 qRT-PCR分析檢測p21 mRNA相對表達(dá)量

2.2Westen blot檢測 Western blot結(jié)果顯示，miR-1180組較dsControl組p21蛋白表達(dá)明顯升高，CDK4、CDK6和CyclinD1蛋白顯著下調(diào)(圖3)。

2.3流式細(xì)胞儀分析轉(zhuǎn)染后腎癌細(xì)胞周期分布 相比dsControl組，轉(zhuǎn)染miR-1180后786-O和ACHN細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，S期和G2/M期細(xì)胞比例顯著減少，提示細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期(圖5)。

圖3 Western blot圖

A：786-O細(xì)胞；B：ACHN細(xì)胞；*：P<0.05，**P<0.01，與dsControl組比較

圖4 Western blot檢測蛋白相對表達(dá)量

A：786-O細(xì)胞；B：ACHN細(xì)胞；*：P<0.05，**：P<0.01，與dsControl組比較

圖5流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

A：786-O細(xì)胞；B：ACHN細(xì)胞；*P<0.05，**P<0.01，與dsControl組比較

圖6 MTS實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后腎癌細(xì)胞活力

A：786-O細(xì)胞；B：ACHN細(xì)胞；*：P<0.05，**：P<0.01，與dsControl組比較

圖7細(xì)胞集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

2.4MTS法檢測腎癌細(xì)胞活力 相比dsControl組，轉(zhuǎn)染miR-1180后腎癌細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)。見圖6。

2.5集落培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)檢測轉(zhuǎn)染后腎癌細(xì)胞增殖能力 相比dsControl組，miR-1180組形成的集落數(shù)顯著減少(P<0.05)。見圖7。

3 討 論

miRNAs是一類長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，廣泛參與細(xì)胞生長、分化、衰老和凋亡等多種細(xì)胞功能的改變，研究發(fā)現(xiàn)miRNA在多種腫瘤組織內(nèi)存在異常表達(dá)，提示miRNA與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[7-8]。以往研究認(rèn)為，miRNA在轉(zhuǎn)錄后水平通過與靶基因mRNA的3′端非編區(qū)相結(jié)合，特異性地抑制mRNA的翻譯或者直接導(dǎo)致其降解，從而抑制相應(yīng)基因的表達(dá)[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，miRNA亦能在轉(zhuǎn)錄水平通過作用于基因的啟動子，從而顯著上調(diào)基因的表達(dá)，這種現(xiàn)象稱為RNA激活現(xiàn)象，具有RNA激活作用的小分子RNA稱為小激活RNA(saRNA)[4,10]。近年來RNA激活現(xiàn)象在腎癌中的研究較少，因而通過激活抑癌基因表達(dá)干擾腎癌細(xì)胞的生長成為研究的重點(diǎn)。

p2l蛋白廣泛參與多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等，具有最廣泛細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制活性，可通過抑制腫瘤細(xì)胞周期的進(jìn)展抑制腫瘤細(xì)胞的生長[3]。細(xì)胞周期蛋白依賴激酶(CDK)和細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)是調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)展的核心蛋白。CDK4和CDK6可分別與Cyclin D1結(jié)合形成Cyclin D1-CDK4和Cyclin D1-CDK6復(fù)合物，作用于細(xì)胞周期的G1/S期，導(dǎo)致細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)展[11-12]。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶p21可以抑制Cyclin D-CDK復(fù)合物的形成或活性，從而抑制細(xì)胞進(jìn)入DNA合成期即S期，引起細(xì)胞周期的停滯[13]。miR-1180是新近發(fā)現(xiàn)的一種可明顯激活p21蛋白表達(dá)的小分子RNA[5]，但未在腎癌細(xì)胞中進(jìn)行過驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)中，通過轉(zhuǎn)染miR-1180至腎癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)腎癌細(xì)胞中p21 mRNA和相應(yīng)蛋白的水平均明顯升高，提示miR-1180具有激活腎癌細(xì)胞p21基因表達(dá)作用；腎癌細(xì)胞的細(xì)胞周期受到明顯地抑制，腎癌細(xì)胞的活力和增殖能力明顯降低，表明miR-1180可以顯著抑制腎癌細(xì)胞的生長[14]。有研究表明，saRNA的激活作用與saRNA的濃度密切相關(guān)[15]。本實(shí)驗(yàn)的不足之處在于未能證明miR-1180在腎癌細(xì)胞中的激活效應(yīng)與miR-1180轉(zhuǎn)染濃度之間的關(guān)系。筆者下一步將通過設(shè)置不同miR-1180轉(zhuǎn)染濃度，驗(yàn)證不同濃度下RNA激活效應(yīng)的不同，從而找出最佳的miR-1180轉(zhuǎn)染濃度。另外，通過動物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-1180在體內(nèi)的p21基因激活效應(yīng)。

綜上所述，miR-1180可明顯激活腎癌細(xì)胞中抑癌蛋白p21的表達(dá)，并顯著抑制腎癌細(xì)胞的生長，有望作為新的腎癌靶基因治療位點(diǎn)。

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