吳艷瓊,柯昌斌,許先成,孫艷玲,王賢裕

(湖北省十堰市太和醫(yī)院麻醉科 442000)

骨癌痛是一種復(fù)雜難治的慢性疼痛，其確切的發(fā)病機(jī)制尚未明了。趨化因子CXC配體13(CXCL13)是CXC趨化因子的一種，主要參與機(jī)體的免疫及炎性反應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CXCL13在神經(jīng)系統(tǒng)中存在表達(dá)，并通過激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞參與慢性疼痛的形成與維持，如神經(jīng)病理性痛、炎性痛等[1]。骨癌痛中小膠質(zhì)細(xì)胞的激活已被證實(shí)[2-4]，其激活參與神經(jīng)元結(jié)構(gòu)與功能的重塑，介導(dǎo)痛覺過敏的產(chǎn)生和痛覺的持續(xù)狀態(tài)，而CXCL13是否參與骨癌痛的病理、生理過程，有待探討。因此，本研究擬觀察脛骨癌痛大鼠CXCL13表達(dá)水平及小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況，評價CXCL13在骨癌痛中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 健康成年雌性SD大鼠120只，體質(zhì)量160～200 g，實(shí)驗(yàn)室溫、濕度分別保持為22～24 ℃和40%～60%，采用12 h晝夜周期光照，自由進(jìn)食、飲水。陰性對照siRNA和CXCL13-siRNA均由上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司合成。將120只大鼠分為4組：假手術(shù)組(S組)、骨癌痛組(BP組)、小干擾RNA(siRNA)陰性對照(NC-siRNA)組(NC組)和CXCL13-siRNA組(CS組)，每組5例。

1.2方法

1.2.1大鼠脛骨癌痛模型制備 將凍存于液氮中的Walker-256乳腺癌細(xì)胞復(fù)蘇后，種植于傳代用雌性SD大鼠腹腔，飼養(yǎng)7 d左右出現(xiàn)大量腹水，局部消毒后從腹腔抽取含腫瘤細(xì)胞的腹水20 mL；經(jīng)離心沉淀后，稀釋至所需濃度約每毫升1×108個細(xì)胞，保存于冰上備用。腹腔注射氯胺酮50 mg/kg麻醉，BP組、NC組和CS組均采用脛骨髓腔內(nèi)注射等量Walker-256乳腺癌細(xì)胞的方法建立大鼠脛骨癌痛模型，三組大鼠于左脛骨上段切開約5 mm小口，暴露脛骨，5 mL注射器針頭于骨上穿刺打孔，再用微量注射器緩慢注入腫瘤細(xì)胞懸浮液5 μL(1×104個)，骨蠟封堵針孔，沖洗并縫合皮膚，創(chuàng)口處涂青霉素鈉粉末預(yù)防感染。S組脛骨髓腔內(nèi)注射等量生理鹽水，其余處理同上。于造模即刻起，NC組鞘內(nèi)注射NC-siRNA慢病毒10 μL(108TU/mL)；CS組鞘內(nèi)注射CXCL13-siRNA慢病毒10 μL(108TU/mL)。

1.2.2機(jī)械痛閾檢測 參照文獻(xiàn)[5]分別于造模前1 d，術(shù)后7、9、14、21 d時采用von FreyTM動態(tài)足底觸覺測量儀(意大利UGO公司)測定大鼠機(jī)械縮足閾值(MWT)。大鼠置于金屬籠(10 cm×10 cm×15 cm)，適應(yīng)環(huán)境20 min，處于靜息狀態(tài)時，開始測定，von Frey絲由下向上垂直刺激右側(cè)足底中部皮膚，設(shè)定20 s內(nèi)刺激逐漸由0升高為50 g，當(dāng)出現(xiàn)快速縮足反應(yīng)時，刺激自動停止，記錄壓力值，共測3次，間隔5 min，取其平均值作為MWT。

1.2.3HE染色觀察骨結(jié)構(gòu)破壞情況 取假手術(shù)和造模后大鼠脛骨。先用4%多聚甲醛固定1周，再在含10%乙二胺四乙酸(EDTA)的固定液中脫鈣4周，石蠟切片。HE染色，鏡下觀察腫瘤生長和骨結(jié)構(gòu)的破壞情況。

1.2.4免疫熒光雙標(biāo)檢測 痛閾測定結(jié)束后，麻醉下迅速暴露心臟，用4%多聚甲醛經(jīng)左心室灌注，取L4～L6脊髓組織常規(guī)固定,30%蔗糖脫水至沉底，冰凍連續(xù)切片(厚15 μm)，加入封閉液，室溫孵育30 min，PBS漂洗后，同時加入1∶500多克隆山羊抗大鼠CXCL13抗體(美國Abcam公司)和1∶1 000單克隆小鼠抗大鼠NeuN抗體(美國Millipore公司),孵育12 h后，PBS洗滌3次，加入相應(yīng)熒光標(biāo)記二抗，室溫孵育2 h后，PBS洗滌3次，用50%甘油封片。激光共聚焦熒光顯微鏡(德國Zeiss公司)觀察CXCL13在神經(jīng)元上的表達(dá)情況和小膠質(zhì)細(xì)胞活化情況。

1.2.5Western blot檢測CXCL13和Iba-1蛋白表達(dá) 取L4～L6脊髓，加組織裂解液，經(jīng)冰浴勻漿后抽提總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量，取上樣蛋白50 μg(20 μL)，經(jīng)10%SDS-PAGE凝膠分離蛋白轉(zhuǎn)膜2 h，5%脫脂牛奶室溫封閉膜1 h；用TBST洗膜3次，加入β-actin(1∶3 000，美國Chemicon公司)和1∶1 000稀釋的羊抗大鼠CXCL13抗體、1∶1 000稀釋的兔抗大鼠Iba-1抗體，洗膜3次，再加二抗(美國Jackson 公司)，室溫孵育2 h，洗膜3次，加入ECL顯色液顯色。應(yīng)用全自動凝膠圖像分析系統(tǒng)對顯影膠片進(jìn)行掃描與分析，以CXCL13和Iba-1條帶積分光密度值與β-actin條帶吸光度值的比值反映CXCL13和Iba-1的蛋白表達(dá)。

1.2.6RT-PCR法檢測CXCL13和Iba-1 mRNA表達(dá) 從組織標(biāo)本提取總mRNA，-70 ℃凍存。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，遵循PCR引物沒計(jì)原則，以GAPDH作為內(nèi)參照，引物由上海生物工程公司合成，序列見表1。擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，共45個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。計(jì)算CXCL13和Iba-1與內(nèi)參照GAPDH的比值作為目的基因的相對表達(dá)量。

表1 RT-PCR 引物序列

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠術(shù)后不同時點(diǎn)機(jī)械痛閾的比較 與S組比較，BP和NC組接種后第9天機(jī)械痛閾顯著下降，并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(P<0.05)；與BP組比較，CS組造模后第9天機(jī)械痛閾顯著升高，并持續(xù)至實(shí)驗(yàn)結(jié)束(P<0.05)，見表2。

表2 各組大鼠術(shù)后不同時點(diǎn)機(jī)械痛閾的比較

a：P<0.05，與S組比較；b：P<0.05，與N組比較

2.2HE染色結(jié)果 光鏡下觀察顯示S組骨髓腔內(nèi)見各種正常的骨髓細(xì)胞，無異常骨結(jié)構(gòu)的改變，模型組術(shù)后7 d大鼠注射側(cè)脛骨骨髓腔內(nèi)及骨小梁間被大量腫瘤細(xì)胞填充，腫瘤細(xì)胞生長活躍，已穿破骨皮質(zhì)，侵及周圍肌肉及軟組織，后期出現(xiàn)骨質(zhì)破壞和病理性骨折,見圖1。

A:S組；B：模型組術(shù)后7 d；C：模型組術(shù)后14 d;D：模型組術(shù)后21 d

圖1 S組與模型組骨結(jié)構(gòu)病理學(xué)結(jié)果(×300)

圖2 脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞在各組中的活化情況(×40)

圖3 CXCL13在各組大鼠脊髓中的表達(dá)分布(×20)

2.3免疫熒光雙標(biāo)結(jié)果 骨癌痛大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞明顯活化，CXCL13-siRNA慢病毒脊髓注射則明顯減少其活化(圖2)；CXCL13在神經(jīng)元中存在表達(dá)，骨癌痛大鼠脊髓中CXCL13表達(dá)升高；CXCL13-siRNA慢病毒脊髓注射則明顯減少CXCL13的表達(dá)(圖3)。

2.4CXCL13和Iba-1蛋白及mRNA表達(dá)水平 與S組比較，BP和NC組CXCL13和Iba-1蛋白及mRNA水平明顯上調(diào)(P<0.05)；與BP組比較，CS組CXCL13和Iba-1蛋白及mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05),見表4、5。

表4 各組大鼠術(shù)后脊髓CXCL13、Iba-1蛋白表達(dá)的比較

a：P<0.05，與S組比較;b：P<0.05，與BP組比較

表5 各組大鼠術(shù)后脊髓CXCL13、Iba-1 mRNA表達(dá)的比較

a：P<0.05，與S組比較；b：P<0.05，與BP組比較

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[6]建立大鼠脛骨癌痛模型，該模型操作簡單，評價方法成熟，與人類骨癌痛病理生理學(xué)特征相似，已被廣泛應(yīng)用于骨癌痛的實(shí)驗(yàn)研究。本研究中，模型組大鼠術(shù)后各測量時點(diǎn)機(jī)械痛閾降低，并出現(xiàn)漸行性加重的自發(fā)痛行為，脛骨HE染色顯示骨質(zhì)嚴(yán)重破壞，假手術(shù)組未見明顯異常，行為學(xué)及骨破壞研究結(jié)果均提示該模型制備成功。

趨化因子CXCL13屬CXC類趨化因子,是定向趨化B細(xì)胞的主要調(diào)節(jié)因子,與B細(xì)胞表面的相應(yīng)受體發(fā)生特異性結(jié)合后可調(diào)控B細(xì)胞的定向趨化。在慢性疼痛、腫瘤、自身免疫性疾病及多種感染性疾病中,各種T、B、單核細(xì)胞都會大量聚集,誘導(dǎo)CXCL13在脊髓及局部組織中大量表達(dá),從而導(dǎo)致疼痛、炎癥的發(fā)生及局部組織器官的損傷[7-8],由此可見CXCL13的異常在許多疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中有著重要作用。本研究結(jié)果表明，鞘內(nèi)注射CXCL13-siRNA慢病毒干擾后，CXCL13在神經(jīng)元的表達(dá)下調(diào)，脊髓CXCL13表達(dá)亦下調(diào)，大鼠對疼痛的耐受程度增強(qiáng)，提示CXCL13參與了骨癌痛的發(fā)生與發(fā)展。

在脊髓水平，膠質(zhì)細(xì)胞不僅對神經(jīng)元起營養(yǎng)與支持作用，還參與了疼痛的調(diào)節(jié)和整合[8]。研究證實(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞在慢性神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，可減少促炎因子的分泌，抑制興奮性氨基酸、一氧化氮等致痛物質(zhì)的釋放，從而導(dǎo)致脊髓背角痛覺神經(jīng)元的興奮性降低[9]。在骨癌痛研究中證實(shí)，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞大量激活是引起癌癥患者產(chǎn)生疼痛的重要因素，鞘內(nèi)給予小膠質(zhì)細(xì)胞抑制劑，可使癌痛大鼠的痛閾顯著增加，明顯減輕其痛行為[10]。本研究中，與S組比較，BP、NC組術(shù)后各測量時點(diǎn)Iba-1蛋白表達(dá)上調(diào)，同時脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞明顯增生、肥大，而CS組則出現(xiàn)小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目及突起數(shù)降低，胞體皺縮，提示小膠質(zhì)細(xì)胞的活化參與了大鼠脛骨癌痛的形成。

本研究中，通過檢測小膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記物Iba-1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)注射CXCL13-siRNA慢病毒后大鼠脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞活化程度受到明顯地抑制，CXCL13的表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞的活化具有同步性，證實(shí)了CXCL13的活化是調(diào)節(jié)疼痛敏感的重要環(huán)節(jié)。其作用機(jī)制可能是癌痛產(chǎn)生后神經(jīng)元通過自身合成分泌的免疫因子參與小膠質(zhì)細(xì)胞活性的調(diào)控，激活小膠質(zhì)細(xì)胞，從而增強(qiáng)突觸后脊髓背角痛覺傳遞神經(jīng)元的敏感性和反應(yīng)性，導(dǎo)致中樞敏化[11]，加重骨癌痛。

綜上所述，脊髓CXCL13通過激活小膠質(zhì)細(xì)胞參與了大鼠骨癌痛的形成與維持，抑制CXCL13與小膠質(zhì)細(xì)胞之間的活化通路，能夠有效地阻止或逆轉(zhuǎn)疼痛的發(fā)生。

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