李 婭，唐國(guó)珍，佟秀琴

(1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 成都 610500； 2.包頭市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，內(nèi)蒙古 包頭 014040)

卵巢癌在女性惡性腫瘤中較常見，因患者癥狀不典型，早期診斷缺乏依據(jù)，多數(shù)病例確診時(shí)已到晚期，致使死亡率居高不下。雖卵巢惡性腫瘤細(xì)胞對(duì)減滅術(shù)和化療有效，但多重耐藥特點(diǎn)，據(jù)統(tǒng)計(jì)上皮性卵巢癌五年生存率為25%～30%[1]。近年來研究表明 DLL4配體又稱DSL(Delta like 4)蛋白，表達(dá)于血管發(fā)展網(wǎng)絡(luò)中，參與血管生成、DLL4-Notch信號(hào)通道、組織細(xì)胞之間通訊傳遞、調(diào)控器官細(xì)胞發(fā)育方面高度保守[2]。研究證實(shí)DLL4配體在正常血管內(nèi)皮中呈安靜狀態(tài)，在血管生長(zhǎng)系統(tǒng)中呈活躍狀態(tài)[3]。神經(jīng)遷移因子Slit2(Slit Homogene 2)是分泌型細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的一種，在果蠅體內(nèi)得到證實(shí)，分布于神經(jīng)組織、血管內(nèi)皮細(xì)胞、多種實(shí)體瘤組織中。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)Slit2因子或是重組Slit2因子可顯著控制腫瘤細(xì)胞襲擊[4]。有關(guān)二者在卵巢惡性腫瘤中表達(dá)及相互作用，國(guó)內(nèi)外報(bào)道罕見。本實(shí)驗(yàn)通過檢測(cè)上皮性卵巢組織中兩者表達(dá)情況，為提升上皮性卵巢癌婦女生存率提供參考。

1材料與方法

1.1材料

卵巢石蠟標(biāo)本來源于2009年1月1日至2016年12月30日包頭市中心醫(yī)院病理科，共120例，其中30例正常卵巢組織、30例上皮性良性腫瘤組織、30例上皮性交界性腫瘤組織、30例上皮性惡性腫瘤組織。四組患者年齡45～55歲，平均50.24歲，四組年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。本實(shí)驗(yàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：采集標(biāo)本均得到倫理委員會(huì)審批且患者均知情并簽署同意書。所有病理切片均經(jīng)兩位病理專家核實(shí)，術(shù)前均未進(jìn)行過放療、化療、激素類藥物治療等。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑

Rabbit Anti-DLL4/Delta 4、Rabbit Anti-Slit2/Slit3、過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素染色試劑盒(SP-0024免疫組化染色試劑盒)、DAB 染色劑均采購北京博奧森公司，包頭市中心醫(yī)院病理科提供檸檬酸鹽修復(fù)液、PBS 緩沖液、蘇木精液、不同濃度二甲苯液、不同濃度無水乙醇、蒸餾水、枸櫞酸緩沖液、中性樹膠封片、載玻片。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)采用免疫組化(strept avidin-biotin complex，SABC)法，具體步驟如下：①術(shù)后取下標(biāo)本置于10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，做 4μm 厚度連續(xù)切片；② 60℃恒溫醫(yī)用烤箱烘烤后，依次放置二甲苯 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 容器中脫蠟，遞減濃度酒精中水化；③高溫加熱5 分鐘后斷電、自然冷卻至室溫，經(jīng)0.1mmol/L PBS 緩沖液沖洗后， 0.3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，再次 0.1 mmol/L PBS 緩沖液沖洗；④參照SP-0024 免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行后，DAB顯色5～8分鐘，蘇木精染色、在濃度遞增的酒精中脫水、二甲苯透明、常規(guī)封片，最后兩位高年資病理科醫(yī)生顯微鏡下閱片；⑤以PBS緩沖液代替一抗作對(duì)比。

1.3評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)

DLL4、Slit2表達(dá)細(xì)胞質(zhì)中，呈現(xiàn)棕黃色顆粒，按照染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例評(píng)分：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分，陽性細(xì)胞數(shù)分級(jí)：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分，陽性表達(dá)為兩項(xiàng)之和≥3。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1 DLL4、Slit2 在上皮性卵巢組織學(xué)類型表達(dá)

DLL4配體、Slit2在卵巢細(xì)胞胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黃色顆粒(見圖1、圖2)。DLL4在惡性腫瘤組陽性表達(dá)率為83.33%，顯著高于交界性腫瘤組、良性腫瘤組、正常卵巢組(均P<0.01)。除惡性腫瘤組，其余三組兩兩比較無顯著性差異(均P>0.05)。Slit2陽性在惡性腫瘤組表達(dá)率為36.67%(11/30)，顯著低于交界性腫瘤組、良性腫瘤組表達(dá)、正常卵巢組陽性表達(dá)率(均P<0.05)，卵巢上皮性惡性腫瘤組陽性表達(dá)率顯著低于正常卵巢組、上皮性卵巢良性腫瘤組(均P<0.05)。正常卵巢組織、良性腫瘤組織、交界性腫瘤組三組兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表1。

2.2上皮性卵巢惡性腫瘤中DLL4、Slit2相關(guān)性表達(dá)

上皮性卵巢惡性腫瘤組30例中有25例DLL4呈陽性表達(dá)，11例Slit2呈陽性表達(dá)，通過Spearman相關(guān)分析，DLL4與Slit2呈負(fù)相關(guān)(r=-0.365，P=0.047)。

注：A為正常卵巢；B為良性卵巢腫瘤；C為交界性腫瘤；D為惡性腫瘤。

圖1 DLL4在上皮性卵巢組織中表達(dá)(SP×400)

Fig.1 Expression of DLL4 in epithelial ovarian tissues (SP×400)

注：A為正常卵巢;B為良性卵巢腫瘤;C為交界性腫瘤;D為惡性腫瘤。

圖2 Slit2在上皮性卵巢組織中表達(dá)(SP×400)

Fig. 2 Expression of Slit2 in epithelial ovarian tissues (SP×400)

表1 DLL4配體、Slit2蛋白在上皮性卵巢組織四種類型中表達(dá)[n(%)]

Table 1 Expressions of DLL4 and Slit2 in four types of epithelial ovarian tissues [n(%)]

注：a、b、c分別為正常卵巢組織、卵巢上皮性良性腫瘤組織及卵巢上皮性交界性腫瘤組織與卵巢上皮性惡性腫瘤組織的比較。

3討論

3.1 DLL4在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及意義

DLL4是Notch配體，對(duì)組織鄰近細(xì)胞之間信號(hào)傳導(dǎo)、調(diào)控器官細(xì)胞發(fā)育發(fā)揮著舉足輕重的作用。DLL4配體表達(dá)在胚胎發(fā)育動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、血管發(fā)育形成的尖端細(xì)胞及動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞[5]。本研究結(jié)果表明，在上皮性卵巢惡性腫瘤組、上皮性卵巢交界性腫瘤組、上皮性卵巢良性腫瘤組織、正常卵巢組織中，DLL4陽性表達(dá)呈依次遞減趨勢(shì)，其中卵巢惡性腫瘤組陽性表達(dá)率均顯著高于其余三組(P<0.05)，而正常卵巢組織、良性腫瘤組織、交界性腫瘤組織之間兩兩比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，提示卵巢腫瘤細(xì)胞可能有促進(jìn)血管新生，而DLL4的過度表達(dá)，與VEGF-A協(xié)同調(diào)節(jié)腫瘤血管萌發(fā)和分支，使得與側(cè)支血管吻合明顯減少，腫瘤組織血管微環(huán)境得以改善，這與俞嵐等[6]觀點(diǎn)一致。本研究阻斷Notch1/DLL4 信號(hào)，通過產(chǎn)生非功能性血管，減少了組織灌注，造成腫瘤組織缺血、缺氧，從而抑制上皮性卵巢癌發(fā)展。就此觀點(diǎn)，在其他器官疾病中得到證實(shí)，如肝癌[7]、 非小細(xì)胞肺癌[8]、糖尿病視網(wǎng)膜病變[9]中均呈高表達(dá)，這些研究進(jìn)一步證實(shí)DLL4配體與腫瘤多種臨床因素有關(guān)，如：臨床分型、腫塊大小、分化等級(jí)、轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān)，而與性別、年齡無關(guān)。本實(shí)驗(yàn)不足之處在于因卵巢腫瘤組織類型多種多樣、收集標(biāo)本數(shù)量有限、且上皮性卵巢惡性腫瘤手術(shù)均為不全根治手術(shù)，故未對(duì)上皮性卵巢惡性腫瘤浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等相關(guān)臨床因素分析。

3.2 Slit2在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)及意義

腫瘤細(xì)胞中Slit/Robo信號(hào)通路由Slit2蛋白、Robo1、Robo4受體主導(dǎo)，Slit2是新型抑癌基因[10]。Slit2 與不同Robo 受體協(xié)同調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、白細(xì)胞及惡性腫瘤血管的生成[11]。本實(shí)驗(yàn)研究表明：Slit2陽性表達(dá)率在惡性腫瘤組織、交界性腫瘤組織、良性腫瘤組織、正常卵巢組織逐漸上升，這說明Sli2在上皮性卵巢惡性腫瘤中起到抑制作用，機(jī)制可能通過Slit2啟動(dòng)子甲基化，雜合性丟失，基因突變、缺失、過表達(dá)等原因?qū)е禄虻捅磉_(dá)[12]，誘發(fā)上皮性卵巢惡性腫瘤的發(fā)生。而Slit2在惡性腫瘤中的表達(dá)存在爭(zhēng)議，有學(xué)者認(rèn)為Slit2通過血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移促進(jìn)腫瘤血管生成[13]，推測(cè)通過切斷Slit2 與Robo之間信號(hào)傳遞，VEGF下調(diào)，廣泛有效地抑制血管生長(zhǎng)[14]。

在卵巢上皮性惡性腫瘤中，DLL4配體呈高表達(dá)，推測(cè)腫瘤新血管發(fā)展受內(nèi)皮細(xì)胞上尖端細(xì)胞、桿細(xì)胞比例調(diào)節(jié)，尖端細(xì)胞對(duì)新血管萌芽、分支占主導(dǎo)地位，桿細(xì)胞延伸新血管分支，DLL4-Notch 信號(hào)通路按比例調(diào)節(jié)尖端細(xì)胞、桿細(xì)胞，促進(jìn)新血管萌芽和分支，通過協(xié)同VEGFR調(diào)控新生血管網(wǎng)的生成及完善血管功能，使卵巢惡性腫瘤血供增加，推動(dòng)發(fā)展。Slit2在上皮性卵巢惡性腫瘤中呈低表達(dá)。推測(cè)通過滅活Src家族酶，Slit2結(jié)合Robo4受體，阻礙由VEGF參與的促血管生成，或阻礙VEGF-165誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞遷移，具體機(jī)制有待探討。由此推測(cè)DLL4、Slit2通過VEGF，在卵巢上皮性惡性腫瘤中起到相反的作用，此結(jié)果應(yīng)增加樣本含量，對(duì)卵巢組織學(xué)進(jìn)行分型，從細(xì)胞學(xué)層面進(jìn)一步探討兩者在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)關(guān)系。

[1]Schrepf A,Thaker P H,Goodheart M J,etal.Diurnal cortisol and survival in epithelial ovarian cancer[J].Psychoneuroendocrinology,2015,53:256-267.

[2]熊愛為,謝靜燕. Notch 信號(hào)通路及其在卵巢癌細(xì)胞中的作用[J]. 中國(guó)婦幼健康研究,2015,26(5):1100-1102.

[3]Liu Z,Fan F,Wang A,etal.Dll4-Notch signaling in regulation of tumor angiogenesis[J].J Cancer Res Clin Oncol,2014,140(4):525-536.

[4]張明慧,周希瑗.腺病毒介導(dǎo)slit2基因轉(zhuǎn)染人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞對(duì)RF/6A細(xì)胞遷移及管腔形成的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,37(16):1619-1623.

[5]Yu S,Sun J H,Zhang J G,etal.Aberrant expression and association of VEGF and Dll4/Notch pathway molecules under hypoxia in patients with lung cancer[J].Histol Histopathol,2013, 28(2):277-284.

[6]俞嵐,焦云杰,周蕾,等.上皮性卵巢癌中八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子4、Notch1及DLL4的表達(dá)及其臨床意義[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2017,37(4):444-450.

[7]劉航,汪偉民,張劍波,等.HIF-2α-VEGF-Notch信號(hào)通路在高強(qiáng)度聚焦超聲不完全消融后肝癌中的作用[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2017,39(7):608-615.

[8]王維,李強(qiáng),韓青松,等.HIF-α、VEGF 和 DLL4在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義[J].解放軍醫(yī)藥雜志,2016,28(5):44-47,53.

[9]郭慶敏. Notch1、Dll4在糖尿病性視網(wǎng)膜病變新生血管形成中的作用研究[D].青島:青島大學(xué),2016.

[10]Qi C,Lan H,Ye J,etal.Slit2 promotes tumor growth and invasion in chemically induced skin carcinogenesis[J].Lab Invest,2014,94(7):766-776.

[11]Li P,Peng H,Lu W H,etal.Role of Slit2/Robo1 in trophoblast invasion and vascular remodeling during ectopic tubal pregnancy[J].Placenta,2015,36(10):1087-1094.

[12] Dong R,Yu J,Pu H,etal.Frequent SLIT2 promoter methylation in the serum of patients with ovarian cancer[J].J Int Med Res,2012,40(2):681-686.

[13]Li S,Huang L,Sun Y,etal.Slit2 promotes angiogenic activity via the Robo1-VEGFR2-ERK1/2 pathway in both in vivo and in vitro studies[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2015,56(9):5210-5217.

[14] Tang W,Tang J,He J,etal.SLIT2/ROBO1-miR-218-1-RET/PLAG1:a new disease pathway involved in Hirschsprung's disease[J]. J Cell Mol Med,2015,19 (6): 1197-1207.