葉建紅，陳雪紅，包麗麗，劉麗杰

(臨海市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 臨海 317016)

近年來，發(fā)展中國家宮頸癌的發(fā)病率和死亡率呈持續(xù)增長、年輕化趨勢，據(jù)統(tǒng)計全世界女性常見癌癥中，宮頸癌位居第二，其中有80%的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國家[1]。在美國，每年通過宮頸細(xì)胞學(xué)檢測開展宮頸癌普查項目，致使宮頸癌的發(fā)病率和死亡率有所下降。人乳頭瘤狀病毒(human papillo￣maviru，HPV)感染是宮頸癌發(fā)生的誘發(fā)因素，若能早期發(fā)現(xiàn)將有助于減少罹患宮頸癌的風(fēng)險[2]。然而，HPV DNA檢測特異度較低，與宮頸脫落細(xì)胞學(xué)聯(lián)合檢測的方法費用較高。宮頸上皮細(xì)胞中存在致癌基因E6和E7蛋白的過度表達(dá)，HPV E6/E7 mRNA是監(jiān)測HPV感染并預(yù)測宮頸病變的重要評估因素[3]。HPV DNA包括2個編碼病毒衣殼蛋白的基因(L1、L2)，HPV L1蛋白檢測陽性說明存在一過性HPV感染階段，HPV L1蛋白的缺失說明HPV感染持續(xù)存在或已發(fā)生顯著病變。本研究分別對HPV DNA陽性患者的細(xì)胞學(xué)和組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行了HPV E6/E7 mRNA檢測和HPV L1蛋白檢測，以評估兩種方法在宮頸上皮內(nèi)病變中的診斷價值。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2016年2月至2017年6月在臨海市第二人民醫(yī)院行宮頸液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(thin cytologic test，TCT)的標(biāo)本，其中經(jīng)第二代雜交捕獲法檢測HPV DNA陽性127例，年齡20～75歲，平均年齡(38.6±4.3)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：懷孕或近期妊娠史；子宮內(nèi)膜癌、輸卵管癌、外陰癌或其他惡性腫瘤經(jīng)放化療后的標(biāo)本；既往宮頸或子宮切除手術(shù)史；HPV無關(guān)腺癌或其他腫瘤；免疫系統(tǒng)疾病史。

1.2分組

有103例組織細(xì)胞學(xué)診斷為宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma，SCC)，設(shè)為研究組；24例組織細(xì)胞學(xué)診斷為慢性炎癥和正常，設(shè)為對照組。單因素方差分析結(jié)果顯示，組間一般資料比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表1。

組別組織細(xì)胞學(xué)診斷例數(shù)(n)年齡(歲)研究組CIN12737.7±4.2CIN23238.1±3.9CIN32437.8±4.1SCC2039.1±5.6對照組慢性炎癥+正常2438.5±4.8F0.231P0.442

1.3方法

1.3.1組織細(xì)胞學(xué)診斷

使用窺陰器充分暴露患者宮頸，滅菌棉球輕輕擦去宮頸分泌物，于宮頸管內(nèi)及宮頸外口刷取標(biāo)本，并進(jìn)行制片，光學(xué)顯微鏡下診斷。診斷標(biāo)準(zhǔn)參考國際癌癥協(xié)會對宮頸/陰道脫落細(xì)胞學(xué)的診斷標(biāo)準(zhǔn)。對于診斷異常的患者鏡下取活檢組織，進(jìn)行病理學(xué)診斷，根據(jù)組織異形性程度和范圍進(jìn)行分級。

1.3.2 HPV E6/E7 mRNA的檢測和HPV L1蛋白表達(dá)的檢測

各組分別進(jìn)行HPV E6/E7 mRNA檢測和HPV L1蛋白表達(dá)檢測。采用分支鏈DNA技術(shù)進(jìn)行HPV E6/E7 mRNA檢測，具體操作步驟分為：標(biāo)本漂洗、標(biāo)本裂解、緩沖液配置、布板、封板膜密封雜交板、信號放大與檢測、結(jié)果判定。

采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)進(jìn)行HPV L1蛋白表達(dá)檢測：將各組患者宮頸石蠟包埋組織進(jìn)行切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)等操作，以雙氧水消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，血清封閉后加入HPV L1殼蛋白抗體(抗體濃度1:200)，反應(yīng)過夜后加入二抗(生物素標(biāo)記山羊抗鼠工作液)，反應(yīng)后清洗玻片，DAB顯色后，蘇木素復(fù)染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片后鏡下觀察。陽性染色部位位于病變細(xì)胞的細(xì)胞核中，呈紅棕色。陽性染色標(biāo)準(zhǔn)：發(fā)現(xiàn)1個細(xì)胞核紅染即為陽性染色。

1.3.3觀察指標(biāo)

統(tǒng)計各組HPV E6/E7 mRNA和HPV L1蛋白表達(dá)情況，計算并比較陽性表達(dá)率。統(tǒng)計HPV E6/E7 mRNA和HPV L1兩種檢測方法的符合率。以組織細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，比較兩種檢測方法在宮頸病變中的診斷價值(準(zhǔn)確度、敏感度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值)。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1各組HPV E6/E7 mRNA和HPV L1蛋白表達(dá)情況

研究組HPV E6/E7 mRNA表達(dá)陽性率明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，研究組間不同級別病變HPV E6/E7 mRNA表達(dá)陽性率均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。研究組CIN1 HPV L1蛋白表達(dá)陽性率與對照組比較無顯著性差異(P>0.05)。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，組織細(xì)胞學(xué)診斷級別與HPV E6/E7 mRNA表達(dá)陽性率呈顯著正相關(guān)關(guān)系(r=0.954，P<0.05)；與HPV L1蛋白表達(dá)陽性率呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.976，P<0.05)，各組HPV E6/E7 mRNA和HPV L1蛋白表達(dá)情況比較見表2。

表2 各組HPV E6/E7 mRNA和HPV L1蛋白表達(dá)情況比較[n(%)]

注：*為對照組與研究組比較，#為對照組與CIN1組比較，★為對照組與CIN2組比較，●為對照組與CIN3組比較(Fisher確切概率法檢驗)，◆為對照組與SCC組比較(Fisher確切概率法檢驗)。

2.2 HPV E6/E7 mRNA和HPVL1蛋白兩種檢測方法在宮頸病變中的診斷價值比較

各種檢測方法敏感度、特異度有顯著性差異(均P<0.05)，其中聯(lián)合檢測敏感度最低，特異度最高。各種檢測方法準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較無顯著性差異(均P>0.05)，見表3。

表3 不同檢測方法對宮頸病變的診斷價值比較[%(n/N)]

3討論

3.1 HPV E6/E7 mRNA與宮頸病變

HPV感染是宮頸癌發(fā)生的誘發(fā)因素，HPV可以通過感染宮頸上皮細(xì)胞后導(dǎo)致上皮內(nèi)非典型增生等病理表現(xiàn)，逐漸發(fā)展為宮頸癌變[4]。從HPV感染到宮頸癌的發(fā)生通常需要一個漫長的過程[5]。HPV DNA檢測彌補了宮頸脫落細(xì)胞學(xué)檢查的不足，大大提高了宮頸篩查的敏感性，但特異度較低，后者可能是由于大部分女性在感染HPV后可能在幾年內(nèi)通過自身免疫系統(tǒng)自動清除病毒。目前,將HPV DNA與宮頸脫落細(xì)胞學(xué)聯(lián)合檢測的方法在宮頸癌臨床篩查中普遍開展，雖然提高了診斷的敏感性和特異性，但費用較高。因此尋找一種經(jīng)濟(jì)而有效的HPV陽性預(yù)測手段極為重要。

研究證實，HPV有多種亞型，與宮頸癌關(guān)系密切的包括14種高危型HPV和10種低危型HPV[6]。在高危型HPV DNA的檢測中發(fā)現(xiàn)，宮頸上皮細(xì)胞中存在致癌基因E6和E7蛋白的過度表達(dá)，能夠促進(jìn)細(xì)胞病變的進(jìn)展[7]。HPV E6/E7 mRNA為病毒復(fù)制和持續(xù)感染的生物標(biāo)志物，是監(jiān)測HPV感染并預(yù)測宮頸病變的重要評估因素[8]。本研究結(jié)果顯示，與宮頸組織存在慢性炎癥和正常的病例比較，CIN和SCC的病例存在較高的HPV E6/E7 mRNA陽性表達(dá)率(P<0.05)。且相關(guān)分析結(jié)果顯示，組織細(xì)胞學(xué)診斷級別越高，HPV E6/E7 mRNA表達(dá)陽性率越高(P<0.05)。

3.2 HPV L1蛋白與宮頸病變

HPV分子為雙鏈環(huán)狀DNA分子，包括6個與DNA復(fù)制及細(xì)胞轉(zhuǎn)化有關(guān)的基因(E1、E2、E4、E5、E6、E7)和2個編碼病毒衣殼蛋白的基因(L1、L2)。有研究證實，HPV L1 DNA 和HPV L1蛋白表達(dá)水平能夠在一定水平上反應(yīng)細(xì)胞中病毒復(fù)制狀態(tài)，以及宮頸病變的進(jìn)展[9]。HPV L1蛋白檢測陽性說明存在一過性HPV感染階段，HPV L1蛋白的缺失說明HPV感染持續(xù)存在或已發(fā)生顯著病變[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，組織細(xì)胞學(xué)診斷級別與HPV L1蛋白表達(dá)陽性率呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，組織細(xì)胞學(xué)診斷級別越高，HPV L1蛋白表達(dá)陽性率越低。但本研究也發(fā)現(xiàn)，研究組HPV L1蛋白表達(dá)陽性率與對照組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，但不難發(fā)現(xiàn)，對于組織細(xì)胞學(xué)診斷級別較高的CIN3和SCC，其HPV L1蛋白表達(dá)陽性率低于對照組，但可能由于觀察例數(shù)的限制差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

為進(jìn)一步探討HPV E6/E7 mRNA和HPV L1蛋白兩種檢測方法在宮頸病變中的診斷價值，本研究分別統(tǒng)計了兩種檢測方法及聯(lián)合檢測在宮頸病變中的診斷價值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各種檢測方法敏感度、特異度有顯著性差異(均P<0.05)，其中聯(lián)合檢測敏感度最低，特異度最高。各種檢測方法準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值和陰性預(yù)測值比較無顯著性差異(P>0.05)，表明聯(lián)合檢測方法在鑒別宮頸病變時有較高的特異性。

綜上所述，HPV E6/E7 mRNA和HPV L1蛋白的表達(dá)水平與宮頸病變關(guān)系密切，能夠在一定程度上反應(yīng)病毒致癌能力，聯(lián)合檢測較單獨檢測具有更高的診斷價值，可與HPV DNA檢測方法互為補充，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

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