馬 瑩,陳 奕

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院產(chǎn)科，北京 100026)

胎兒頸項(xiàng)透明層(nuchal translucency，NT)是早孕晚期胎兒頸后皮下液體積聚，超聲征象表現(xiàn)為頸后無(wú)回聲區(qū)。通過(guò)超聲測(cè)量孕11～13+6周胎兒的NT厚度，預(yù)測(cè)胎兒染色體畸變及其他異常的風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步通過(guò)介入性產(chǎn)前診斷，利用分子生物學(xué)或細(xì)胞遺傳學(xué)方法分析胎兒染色體的情況，可降低出生缺陷。隨著我國(guó)計(jì)劃生育政策的改變，高齡產(chǎn)婦增多，如何積極有效地早期預(yù)測(cè)胎兒染色體異常，提高出生人口質(zhì)量的同時(shí)降低介入性產(chǎn)前診斷帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)，有必要探討NT增厚程度與胎兒染色體異常的關(guān)系。然而國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)統(tǒng)一的NT增厚標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)NT 厚度超過(guò)第99 百分位數(shù)(即3.5mm)時(shí)斷定NT增厚無(wú)爭(zhēng)議，但對(duì)NT厚度超過(guò)第95 百分位數(shù)(即2.5mm)判斷為NT增厚有爭(zhēng)議。本研究通過(guò)分析457例NT≥2.5mm胎兒的染色體結(jié)果，探討NT厚度與胎兒染色體異常的關(guān)系，NT臨界厚度(2.5～2.9mm)的臨床意義，以及低覆蓋度大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(low-coverage massively parallel CNV sequencing, CNV-seq)結(jié)合短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats, STR)檢測(cè)對(duì)NT≥2.5mm胎兒產(chǎn)前診斷的應(yīng)用價(jià)值。

1資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院2013年1月至2016年12月孕11～13+6周彩色多普勒超聲檢查，提示根據(jù)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)和平面標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量胎兒頂臀長(zhǎng)(CRL)在45～84mm，NT≥2.5mm的在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院就診，并接受介入性產(chǎn)前診斷的孕婦，記錄孕婦的姓名、NT厚度、超聲提示合并結(jié)構(gòu)情況、無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查(non-invasive prenatal testing，NIPT)結(jié)果，穿刺方法及染色體結(jié)果。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)，該項(xiàng)研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 介入性產(chǎn)前診斷

根據(jù)孕婦情況及其知情同意選擇如下方法,①絨毛活檢：孕11～14周經(jīng)腹絨毛活檢;②羊膜腔穿刺：孕18～24周行羊膜腔穿刺。

1.3 染色體的檢測(cè)方法

①絨毛細(xì)胞或羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體核型分析;②熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)；③CNV-seq結(jié)合STR檢測(cè)。北京貝瑞和康生物技術(shù)有限公司進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 NIPT的檢測(cè)方法

經(jīng)檢測(cè)前知情同意后，于孕12～20周抽取孕婦外周靜脈血5mL，置入乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，進(jìn)行二次離心后提取血漿中的 DNA，制備測(cè)序文庫(kù)并質(zhì)控，應(yīng)用高通量測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，將測(cè)序結(jié)果生成的數(shù)據(jù)與人類基因組序列進(jìn)行比對(duì)，生物信息分析不同染色體水平的差異，計(jì)算出胎兒患21三體、18三體及13三體的風(fēng)險(xiǎn)值，風(fēng)險(xiǎn)值為(-3，+3)之間為低風(fēng)險(xiǎn)，超出范圍為高風(fēng)險(xiǎn)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

按NT厚度為2.5～2.9mm、3.0～3.9mm、4.0～5.9mm及6.0mm以上分為四組，比較不同NT厚度各組胎兒染色體異常的情況。使用PASW Statistics 18.0軟件，數(shù)據(jù)資料采用描述統(tǒng)計(jì)頻率方法計(jì)算中位數(shù)，合并結(jié)構(gòu)異常胎兒的NT厚度與不合并結(jié)構(gòu)異常胎兒的NT厚度差異比較采用兩獨(dú)立樣本的Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，合并結(jié)構(gòu)異常與不合并結(jié)構(gòu)異常胎兒染色體異常的差異采用χ2檢驗(yàn)，NT厚度四組間差異采用多個(gè)樣本率構(gòu)成比的多重比較，進(jìn)行列聯(lián)表χ2檢驗(yàn)，均以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如果進(jìn)行兩兩比較則對(duì)檢驗(yàn)水準(zhǔn)進(jìn)行校正，以P值低于校正后檢驗(yàn)水準(zhǔn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1 一般情況

因NT≥2.5mm行介入性產(chǎn)前診斷的孕婦471例，去除資料不全及檢測(cè)失敗者18例，453例孕婦符合入組標(biāo)準(zhǔn)。4例雙胎兩胎兒均NT≥2.5mm，分別行染色體檢查，共納入研究457例胎兒。孕婦年齡19～42歲，中位數(shù)30歲，單胎439例，雙胎14例，NT厚度2.5～13.5mm，中位數(shù)3.5mm。

2.2 其他篩查

入組病例術(shù)前行NIPT提示21三體高風(fēng)險(xiǎn)6例，18三體高風(fēng)險(xiǎn)3例，13三體高風(fēng)險(xiǎn)1例，47XXY 1例，行介入性產(chǎn)前診斷均證實(shí)無(wú)誤，1例NIPT提示X染色體異常，證實(shí)為45X嵌合體，低風(fēng)險(xiǎn)2例，1例無(wú)誤，1例雖然核型分析正常但是測(cè)序技術(shù)證實(shí)有致病性未知的微重復(fù)。

2.3 胎兒結(jié)構(gòu)異常

NT≥2.5mm且超聲提示合并結(jié)構(gòu)異常者55例，包括頸部水囊瘤15例，心臟畸形8例，全身水腫或胸水、腹水21例，鼻骨缺失4例，臍膨出6例，骨骼畸形2例，全前腦1例，巨膀胱1例，單臍動(dòng)脈5例，脈絡(luò)叢囊腫2例，靜脈導(dǎo)管A波反向1例，其他畸形4例。病例中超聲提示結(jié)構(gòu)異常者NT厚度2.5～13.5mm，中位數(shù)為5.6mm，無(wú)結(jié)構(gòu)異常胎兒的NT厚度2.5～13.0mm，中位數(shù)為3.4mm，分析胎兒結(jié)構(gòu)異常的NT厚度與無(wú)結(jié)構(gòu)異常胎兒的NT厚度差異有顯著性(P<0.001)。NT≥2.5mm且超聲提示合并結(jié)構(gòu)異常胎兒中染色體異常26例(47.3%)，合并結(jié)構(gòu)異常與不合并結(jié)構(gòu)異常比較，胎兒染色體異常的差異有顯著性(χ2=23.012，P<0.001)。超聲提示鼻骨缺失4例中3例為21三體，符合率達(dá)75%。

2.4 染色體結(jié)果

核型分析、FISH或兩者聯(lián)合檢測(cè)233例，染色體異常43例(18.5%)。包括13三體1例，18三體10例，21三體25例(包括易位型1例)，45X2例，48XXYY及47XXY各1例，嵌合體3例，分別為45X(88)/46XX(12)，47XYY(17)/46XY(83)，XY(150)/XX(50)。

CNV-seq結(jié)合STR檢測(cè) 224例，同時(shí)行核型分析75例，同時(shí)FISH檢測(cè)1例，發(fā)現(xiàn)染色體異常及拷貝數(shù)變異( copy number variations, CNVs) 99例(44.2%)，除外未知性及多態(tài)性CNVs，457例胎兒中染色體異常檢出率為22.1%(101/457)。染色體數(shù)目異常49例，包括13三體2例，15三體1例，18三體7例，45X 9例，21三體25例，47XXX 1例，嵌合體4例，分別為45X(80%)/46XX(20%)，47XN,+13(60%)/ 46XN(40%)，47XN,+18(80%)/46XN(20%)，45X(60%)/46XX(40%)，最后1例同時(shí)羊水核型分析45X(76)/46XX(24)。CNVs共有50例，包括多態(tài)性15例，未知性26例，致病性9例(4.0%)，致病性9例中5例由于缺失/重復(fù)>5Mb能通過(guò)常規(guī)核型分析檢測(cè)出來(lái)，余4例致病性CNVs片段<5Mb常規(guī)方法不能檢測(cè)出來(lái)，核型分析出遺傳自母親的染色體結(jié)構(gòu)重排3例，CNV-seq結(jié)合STR檢測(cè)未能提示結(jié)構(gòu)重排，其中1例兩者結(jié)合檢測(cè)出染色體結(jié)構(gòu)重排伴有致病性未知的CNVs。

2.5 NT厚度與胎兒染色體異常的關(guān)系

按NT厚度2.5～2.9mm、 3.0～3.9mm、4.0～5.9mm及6.0mm以上分四組，每組例數(shù)及胎兒染色體異常例數(shù)分別為87例，3例(3.5%);190例，35例(18.9%)；111例，32例(28.8%)；69例，31例(44.9%)，統(tǒng)計(jì)當(dāng)NT≥3.0mm總的染色體異常率26.5%。隨NT厚度增加胎兒染色體異常率顯著增加，分析四組間差異有顯著性(χ2=42.878，P<0.001)，兩兩比較并校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)后第一組和其他各組比較差異均有顯著性(P<0.01)，第二組和第四組比較差異有顯著性(P<0.001)，而第二組和第三組、第三組和第四組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表1。NT臨界厚度(2.5～2.9mm)胎兒染色體異常者3例，1例超聲提示鼻骨缺失，2例穿刺術(shù)前行NIPT高風(fēng)險(xiǎn)。

表1 NT厚度組間多個(gè)樣本率構(gòu)成比的比較[n(%)]
Table 1 Comparison of the constituent ratio of multiple sample rates among groups with different NT thicknesses[n(%)]

NT分組總例數(shù)(n)胎兒染色體異常比較分析χ2P①2.5～2.9mm873(3.5)與②比較11.303<0.001與③比較21.5900.001②3.0～3.9mm19035(18.9)與③比較4.3860.036與④比較18.729<0.001③4.0～5.9mm11132(28.8)與④比較4.8470.028④6.0mm以上6931(44.9)與①比較38.843<0.001

注：校正檢驗(yàn)水準(zhǔn)后P<0.0083為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

3.1 NT截?cái)嘀蹬cNT臨界厚度

已知NT增厚是預(yù)測(cè)胎兒染色體異常和多種胎兒畸形的有效超聲軟標(biāo)記。國(guó)內(nèi)研究報(bào)道NT≥2.5mm的發(fā)生率占全部胎兒的1.58%[1]， NT厚度為2.5～3.0mm的病例占1.81%， NT≥3.0mm占0.78%[2]。本文統(tǒng)計(jì)457例NT≥2.5mm胎兒中染色體異常檢出率為22.1%(101/457)，NT厚度為2.5～2.9mm胎兒的染色體異常率為3.5%，和其他各組比較差異均有顯著性，當(dāng)NT≥3.0mm染色體異常率為26.5%。前期鄧洪梅等[1]統(tǒng)計(jì)我院2012年NT≥2.5mm者為173例，12例染色體異常，NT厚度為2.5～3.0mm的胎兒染色體異常率僅1%(1/100)，而NT≥3.5mm的染色體異常率達(dá)16.9%，初步研究出胎兒NT≤3.5mm，孕婦年齡<35歲，唐篩低風(fēng)險(xiǎn)，超聲未提示結(jié)構(gòu)異常，絕大多數(shù)為正常胎兒。一項(xiàng)來(lái)自以色列的多中心研究報(bào)道，將超聲未提示結(jié)構(gòu)異常的NT病例分為三組，NT≤2.9mm、NT3.0～3.4mm及NT≥3.5mm，以微陣列分析 (chromosomal microarray analysis，CMA) 技術(shù)評(píng)價(jià)后認(rèn)為NT截?cái)嘀刀?.0mm更為合理[3]。2016年ACOG發(fā)布了163號(hào)指南，指出孕11～14周NT≥3.0mm或大于相應(yīng)胎兒頭臀長(zhǎng)的99%百分位數(shù)視為NT增厚，并且隨著NT值增厚胎兒非整倍體異常風(fēng)險(xiǎn)增加，建議應(yīng)給予遺傳咨詢，可提供無(wú)創(chuàng)DNA檢測(cè)或絨毛活檢，并且在孕中期應(yīng)進(jìn)行詳細(xì)的超聲篩查和胎兒心臟超聲檢查[4]，本研究數(shù)據(jù)也證實(shí)隨NT厚度增加胎兒染色體異常率顯著增加，與指南一致。但還統(tǒng)計(jì)了NT厚度為2.5～2.9mm胎兒的染色體異常率為3.5%(3/87)，3例染色體異常病例中1例超聲提示鼻骨缺失，2例穿刺術(shù)前行NIPT高風(fēng)險(xiǎn)。

依據(jù)復(fù)習(xí)文獻(xiàn)和研究結(jié)果本研究認(rèn)為將NT截?cái)嘀刀?.0mm，NT厚度為2.5～2.9mm定為臨界厚度較為合理，當(dāng)NT≥3.0mm或合并結(jié)構(gòu)異常建議介入性產(chǎn)前診斷。近幾年來(lái)隨著NIPT的推廣臨床已經(jīng)證實(shí)了其準(zhǔn)確度較高，減少由于介入性產(chǎn)前診斷操作帶來(lái)的手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)，雖然目前NIPT檢測(cè)染色體微小異常價(jià)值有限，但是其無(wú)創(chuàng)性和孕12周后即可進(jìn)行體現(xiàn)其有良好的篩查價(jià)值，應(yīng)重視在早孕期篩查中NT與NIPT的聯(lián)合。國(guó)內(nèi)報(bào)道NT厚度為2.5～3.0mm的病例占1.81%[2]，還應(yīng)重視此部分NT值(即NT第95 百分位數(shù)至截?cái)嘀?胎兒的后續(xù)咨詢。本研究建議當(dāng)NT為臨界厚度即NT 2.5～2.9mm不合并胎兒結(jié)構(gòu)異常時(shí)行NIPT，根據(jù)NIPT的結(jié)果及隨后的中孕期超聲篩查決定下一步處理，如果出現(xiàn)NIPT高風(fēng)險(xiǎn)或中孕期超聲提示超聲軟指標(biāo)再考慮行介入性產(chǎn)前診斷，可增加介入性產(chǎn)前診斷的檢出率，患者接受度也較高，并同時(shí)降低染色體異常兒的漏診。國(guó)內(nèi)尚無(wú)統(tǒng)一的截?cái)嘀禈?biāo)準(zhǔn)，此建議需要更多研究。本研究中核型分析發(fā)現(xiàn)嵌合體3例，CNV-seq結(jié)合STR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)嵌合體4例，其中1例為45X[60%]/46XX[40%]，同時(shí)羊水培養(yǎng)核型分析45X[76]/46XX[24]，考慮兩種方法報(bào)告嵌合比例不一致的原因可能是羊水培養(yǎng)的細(xì)胞發(fā)生了變異。

3.2 NT厚度與拷貝數(shù)變異

致病性NT厚度與CNVs在辨別胎兒染色體疾病方面具有重要作用，目前結(jié)合CMA和染色體核型分析是臨床檢測(cè) CNVs的金標(biāo)準(zhǔn)，可提高染色體異常的檢出率。Maya等[3]報(bào)道統(tǒng)計(jì)無(wú)結(jié)構(gòu)異常的NT≤2.9mm、NT 3.0～3.4mm及NT≥3.5mm病例，對(duì)比NIPT及傳統(tǒng)核型分析CMA技術(shù)檢出染色體異常率明顯增高，檢出各組致病性CNVs率分別為1.7%、7.1%,和13.0%，有報(bào)道經(jīng)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(QF-PCR)檢測(cè)結(jié)果正常的122例NT≥3.5mm病例，行CMA檢出致病性CNVs者7例(5.7%)，其中3例由于缺失/重復(fù)<10MB核型分析不能檢測(cè)出來(lái)[5]，所以對(duì)NT增厚的胎兒使用CMA技術(shù)可使致病性染色體畸變檢測(cè)率提高。本研究通過(guò)CNV-seq結(jié)合STR檢測(cè)224例NT≥2.5mm的胎兒，檢出致病性CNVs 9例(4.0%)，4例致病性CNVs缺失/重復(fù)<5MB常規(guī)染色體核型分析不能檢測(cè)出來(lái)，與上述報(bào)道類似，提示對(duì)NT增厚的胎兒使用CNV-seq結(jié)合STR檢測(cè)可使致病性染色體畸變檢測(cè)率提高。

另外本研究核型分析出遺傳自母親的染色體結(jié)構(gòu)重排3例，2例測(cè)序技術(shù)無(wú)法檢測(cè)出，考慮為平衡性重排，兩者結(jié)合檢測(cè)出另1例胎兒染色體結(jié)構(gòu)重排伴有致病性未知的CNVs，說(shuō)明兩者結(jié)合檢測(cè)分析染色體結(jié)構(gòu)重排情況更全面。有報(bào)道1例NT增厚的胎兒常規(guī)G顯帶分析染色體為45, XX, dic (9;13) (q34;p13)，而CMA分析出9q34.3缺失3.6Mb，并且缺失區(qū)域含有EhMT1基因，在NT增厚但是染色體核型提示結(jié)構(gòu)異常的病例應(yīng)用CMA檢測(cè)更為細(xì)致[6]，與本研究一致。

3.3 NT厚度與胎兒結(jié)構(gòu)異常

隨著超聲儀器分辨率的不斷提高及超聲工作者經(jīng)驗(yàn)的不斷積累，早孕期超聲檢查越來(lái)越普及和項(xiàng)目細(xì)化， 可發(fā)現(xiàn)很多胎兒結(jié)構(gòu)異常，本研究統(tǒng)計(jì)頸部水囊瘤及胎兒水腫、胸腹水及心臟畸形是NT≥2.5mm胎兒超聲圖像中最常發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)異常，NT≥2.5mm合并有結(jié)構(gòu)異常的胎兒染色體異常率達(dá)47.3%，合并結(jié)構(gòu)異常胎兒的染色體異常率顯著高于非合并結(jié)構(gòu)異常者，鼻骨缺失對(duì)21三體的符合率達(dá)75%(3/4)，證實(shí)鼻骨缺失為預(yù)測(cè)21三體敏感性高的超聲指標(biāo)。王莉等[2]報(bào)道孕11～14周超聲檢查發(fā)現(xiàn)可疑胎兒異常28 例，NT≥3.0mm 合并結(jié)構(gòu)異常11 例，19 例NT增厚胎兒中8例合并心臟畸形，提示當(dāng)發(fā)現(xiàn)胎兒NT厚度異常時(shí)應(yīng)仔細(xì)篩查結(jié)構(gòu)。本文還發(fā)現(xiàn)胎兒有結(jié)構(gòu)異常的NT厚度顯著高于無(wú)結(jié)構(gòu)異常胎兒的NT厚度，提示NT厚度增加時(shí)合并胎兒結(jié)構(gòu)異常的可能性也增加。而2013年Sotiriadis等[7]對(duì)20多個(gè)NT相關(guān)研究進(jìn)行Meta分析，染色體核型正常但患有心臟畸形的胎兒中，44%的胎兒NT厚度大于相應(yīng)孕周的第95百分位數(shù)，20%的胎兒NT厚度大于相應(yīng)孕周的第99百分位數(shù)，NT厚度對(duì)胎兒心臟畸形有預(yù)測(cè)意義。Yang等[8]對(duì)220例常規(guī)染色體核型分析正常的NT≥3.0mm胎兒進(jìn)行比較基因組雜交(ACGH)檢測(cè)并結(jié)合孕20～24周的篩畸超聲檢查，在有無(wú)結(jié)構(gòu)異常胎兒中比較CNVs情況，發(fā)現(xiàn)9.1%(20/220)的胎兒存在CNVs，且超聲提示結(jié)構(gòu)異常的胎兒CNVs率顯著高于無(wú)結(jié)構(gòu)異常的胎兒(26.9% vs 6.7%)，提示NT增厚的胎兒雖然染色體核型正常，但當(dāng)超聲提示結(jié)構(gòu)異常應(yīng)考慮存在CNVs。因此當(dāng)超聲提示NT厚度增加和/或發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常時(shí)對(duì)胎兒染色體異常及CNVs有預(yù)測(cè)價(jià)值，即使染色體核型正常，也建議增加胎兒超聲心動(dòng)圖及孕期超聲監(jiān)測(cè)和考慮行CMA或CNV-seq檢測(cè)是否存在CNVs。

除染色體異常外，淋巴系統(tǒng)發(fā)育遲緩、感染、貧血都可能與NT厚度相關(guān)。本研究認(rèn)為NT截?cái)嘀刀?.0mm，NT厚度為2.5～2.9mm定為臨界厚度較為合理，不合并胎兒結(jié)構(gòu)異常臨界厚度的NT病例可以建議行NIPT，視其結(jié)果及隨后的超聲篩查決定下一步處理，可降低染色體異常兒的漏診。NT厚度增加或發(fā)現(xiàn)胎兒結(jié)構(gòu)異常時(shí)即使胎兒染色體核型無(wú)異常也建議增加胎兒超聲心動(dòng)圖及孕期超聲監(jiān)測(cè)，對(duì)NT增厚和/或結(jié)構(gòu)異常的胎兒使用CMA或CNV-seq可使致病性染色體畸變檢測(cè)率提高。

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