唐 濤 張維冰 張 政 夏明珠 貢雪東 王風(fēng)云 李 彤

1(南京理工大學(xué)工業(yè)化學(xué)研究所，南京 210094) 2(齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，齊齊哈爾 161006) 3(大連依利特分析儀器有限公司，大連 116023)

1 引 言

二維液相色譜技術(shù)以其高峰容量、高分辨力的特點(diǎn)，成為近年來蛋白質(zhì)分析[1,2]、中藥成分分析[3,4]、代謝組學(xué)研究[5]的重要方法之一。二維接口是二維液相色譜系統(tǒng)的核心，常見的接口形式可分為離線接口和在線接口兩大類。離線接口[6,7]依次收集第一維的餾分，隨后通過轉(zhuǎn)移進(jìn)行第二維分析。在線接口的形式多種多樣，是二維接口發(fā)展的主要趨勢(shì)。定量環(huán)接口[8,9]利用定量環(huán)存儲(chǔ)第一維的樣品，通過閥切換將樣品切入第二維分析。對(duì)于停流接口[10]，第一維洗脫產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)移到第二維色譜柱柱頭，轉(zhuǎn)動(dòng)切換閥，第二維開始分析，此時(shí)第一維停流。對(duì)于平行柱接口[11]，利用兩支同樣的色譜柱交替富集第一維的樣品，并作為第二維的分析柱使用; 對(duì)于捕集柱接口[12]，第一維的洗脫產(chǎn)物富集到捕集柱柱頭，切換閥后，第二維流動(dòng)相將捕集柱上的樣品反沖到第二維色譜柱上進(jìn)行分析。此外，還有一些特殊的接口形式，如真空輔助溶劑蒸發(fā)接口[13]、液滴微流控接口[14]等。已報(bào)道的這些接口中，離線接口結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，對(duì)設(shè)備要求不高，并可以對(duì)第一維餾分進(jìn)行相應(yīng)的濃縮、合并、脫鹽等操作，但轉(zhuǎn)移過程中易造成樣品損失、污染; 定量環(huán)接口結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，但第二維樣品有效樣品量偏低，影響檢測(cè)靈敏度; 停流接口，第二維不受分析時(shí)間限制，可以充分發(fā)揮系統(tǒng)分辨率，但第一維停流往往容易使樣品擴(kuò)散; 平行柱接口避免了停流接口的擴(kuò)散問題，但第二維分析時(shí)間受到第一維分離時(shí)間的限制; 捕集柱接口有在線富集的功能，可很好的保證第二維樣品濃度，但捕集效率不穩(wěn)定是不可忽略的問題，且第二維分析時(shí)間同樣受到第一維限制?？傮w上，這些接口有各自的優(yōu)點(diǎn)，但也都受到一定的限制，應(yīng)用范圍有限，不能滿足多種分離目的靈活切換的需求; 且自動(dòng)化、集成化程度不高，不適合分析時(shí)間長(zhǎng)、數(shù)量大的樣品。

在本研究組前期工作的基礎(chǔ)上[15,16]， 本研究設(shè)計(jì)了一種兼有樣品收集、進(jìn)樣功能的新型在線/離線接口，可完成樣品微量制備、難分離組分的精細(xì)拆分和復(fù)雜樣品的二維分離。分別以芳香族化合物、蛋白質(zhì)樣品、蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物為分析對(duì)象，對(duì)接口進(jìn)行系統(tǒng)的評(píng)價(jià)，獲得了良好的結(jié)果。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

iChrom 5100高效液相色譜儀，包括P5102高壓恒流泵、D5101紫外-可見檢測(cè)器、M5102系統(tǒng)組織器、W5100色譜數(shù)據(jù)工作站等(大連依利特分析儀器有限公司); FE20 pH計(jì)(瑞士Mettler Toledo公司); C52-1346I兩位六通切換閥(瑞士Valco公司); Biobasic SCX色譜柱(250 mm ×4.6 mm i.d., 5 μm, 300 ?, 美國(guó)Thermofisher 公司); Supersil ODS2色譜柱(250 mm ×4.6 mm i.d., 5 μm, 120 ?, 大連依利特分析儀器有限公司)，SinoChrom C8色譜柱(150 mm×4.6 mm i.d., 5 μm, 300 ?, 大連依利特分析儀器有限公司)。

苯乙酮、甲苯、乙苯、芴、尿素、碳酸氫銨(分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司); 甲醇、乙腈(色譜純，美國(guó)Tedia試劑公司); 細(xì)胞色素C(Cytochrome C, Cyt C)、核糖核酸酶A(RNase A)、核糖核酸酶B(RNase B)、雞卵清白蛋白(Chicken egg white albumin, CEA)、牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)均購(gòu)自Sigma-Aldrich公司; 三氟乙酸(Trifluoroacetic acid, TFA)、二硫蘇糖醇(98%, Dithiothreitol, DTT)購(gòu)自北京百靈威科技有限公司; 碘乙酰胺(99%, Iodoracetamide, IAA, Amresco公司); 實(shí)驗(yàn)用水為超純水(Milli-Q，美國(guó)Millipore公司)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.14種芳香族化合物的微量制備樣品：苯乙酮、甲苯、乙苯、芴(2×10-7g/mL)。進(jìn)樣量為20 μL。收集條件： 1#餾分2.5～3.5 min，2#餾分5.0～6.0 min，3#餾分7.0～8.0 min，4#餾分13.0～14.0 min。再進(jìn)樣條件：收集到4組餾分各1 mL，濃縮至約0.3 mL，再依次進(jìn)樣，進(jìn)樣量為100 μL。色譜條件： Supersil ODS2色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d., 5 μm); 流動(dòng)相為甲醇-水(85∶15,V/V); 流速1.0 mL/min; 檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

2.2.25種蛋白質(zhì)的精細(xì)拆分(1)樣品制備 分別稱取BSA 2.3 mg、Cyt C 2.0 mg、RNase A 2.0 mg、RNase B 4.1 mg和CEA 2.3 mg，用1 mL乙腈-水(2∶98,V/V, 含0.1% TFA)溶解， 0.22 μm濾膜過濾，備用。(2)第一維強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜(Strong cation exchange chromatography, SCX) Biobasic SCX色譜柱(250 mm ×4.6 mm i.d., 5 μm, 300 ?); 流動(dòng)相A為10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 5.37); 流動(dòng)相B為流動(dòng)相A+1.0 mol/L NaCl(pH 5.37); 梯度洗脫條件: 0～30 min，10%～30% B； 30～40 min, 50% B， 流速1.0 mL/min; 進(jìn)樣量20 μL; 檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。(3)第二維反相色譜(Reversed-phase chromatography, RP) SinoChrom C8色譜柱(150 mm×4.6 mm i.d., 5 μm, 300 ?); 流動(dòng)相A為乙腈-水(2∶98,V/V)+0.1% TFA; 流動(dòng)相B為乙腈-水(98∶2,V/V)+0.1% TFA; 梯度洗脫條件: 0～3 min, 5% B; 3～5 min, 5%～25% B; 5～17 min, 25%～75% B; 17～20 min, 75%～5% B。 流量1.0 mL/min; 進(jìn)樣量20 μL; 檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

2.2.3BSA酶解產(chǎn)物的二維分離(1)樣品制備 稱取1.0 mg BSA溶于8 mol/L 尿素和100 mmol/L NH4HCO3緩沖液(pH 8.0)中; 加入8 μL 1 mol/L DTT，60 ℃水浴反應(yīng)2 h; 加入20 μL 1 mol/L IAA，常溫下避光反應(yīng)0.5 h; 隨后使用100 mmol/L NH4HCO3將樣品中尿素濃度稀釋至1 mol/L，并按質(zhì)量比1∶25加入胰蛋白酶，37 ℃下反應(yīng)過夜; 最后，將得到的蛋白質(zhì)酶解液調(diào)至酸性，除鹽后凍干，待用。(2)第一維強(qiáng)陽(yáng)離子交換色譜 Biobasic SCX色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d., 5 μm, 300 ?); 流動(dòng)相A為10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 2.2); 流動(dòng)相B為流動(dòng)相A+0.5 mol/L NaCl(pH 2.2); 梯度洗脫程序： 0～10 min， 0% B; 10～30 min，0～100% B; 30～60 min，100% B; 60～70 min，0% B。流速0.5 mL/min; 進(jìn)樣量100 μL; 檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。(3)第二維反相色譜 XBP C18色譜柱(150 mm × 0.3 mm i.d., 5 μm, 實(shí)驗(yàn)室自制); 流動(dòng)相A為乙腈-水(2∶98,V/V)+0.1% TFA; 流動(dòng)相B為乙腈-水(98∶2,V/V)+0.1% TFA; 梯度洗脫條件: 0～10 min, 0% B; 10～70 min, 5%～35% B; 70～80 min, 100% B; 80～95 min, 0% B。流速8.0 μL/min; 進(jìn)樣量5 μL; 檢測(cè)波長(zhǎng)214 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 在線/離線接口的設(shè)計(jì)

雙回路技術(shù)采用一套機(jī)械傳動(dòng)組件和流路系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)雙重功能。本研究基于一套三維機(jī)械傳動(dòng)裝置控制樣品針以及一套樣品托盤、活塞、兩位三通閥和同一套流路系統(tǒng)，利用2個(gè)兩位六通切換閥，設(shè)計(jì)了一種全新的接口，如圖1所示。通過活塞、樣品針吸入樣品至閥A的定量環(huán)，控制閥A的位置狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)LC-A系統(tǒng)的自動(dòng)進(jìn)樣; 也可通過閥B和閥A的連接和控制，經(jīng)過樣品針，實(shí)現(xiàn)對(duì)LC-B系統(tǒng)分離餾分的收集，形成兩個(gè)可控、互不干擾的回路。同時(shí)，設(shè)計(jì)了配套的色譜數(shù)據(jù)工作站，可集成化控制接口中各個(gè)閥的狀態(tài)和多套液相色譜儀，結(jié)合序列分析和外部觸發(fā)兩種方式，可靈活實(shí)現(xiàn)在線/離線功能。

圖1 在線/離線接口流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of online/offline interface

3.2 接口的功能實(shí)現(xiàn)

進(jìn)樣和餾分收集功能：通過電路和軟件程序控制，控制閥A在實(shí)線狀態(tài)，閥B在實(shí)線狀態(tài)，移動(dòng)樣品針到指定的樣品瓶，通過活塞將樣品吸入閥A的定量環(huán)中，完成上樣; 切換閥A到虛線狀態(tài)，可將樣品推入LC-A系統(tǒng)中進(jìn)行色譜分析，實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣。此時(shí)，通過切換三通閥C，利用活塞吸入清洗溶劑，再切換閥C，推動(dòng)活塞，可實(shí)現(xiàn)清洗樣品針; 同時(shí)也可以通過閥B連接的泵，推入溶劑，清洗樣品針外側(cè)，避免交叉污染。切換閥B到虛線狀態(tài)，LC-B系統(tǒng)分析的樣品，通過閥B，連接閥A，通過樣品針可以收集到指定的樣品瓶中，實(shí)現(xiàn)餾分收集功能。再次控制閥A到實(shí)線狀態(tài)、閥B到實(shí)線狀態(tài)，可重復(fù)上述功能。

3.2.1樣品的微量制備功能當(dāng)LC-A和LC-B是同一系統(tǒng)，利用接口完成進(jìn)樣后，繼續(xù)通過接口按時(shí)間直接收集全部餾分或者按出峰信號(hào)收集感興趣的餾分; 然后對(duì)所收集餾分在線進(jìn)行二次分析，或離線濃縮處理后再分析，獲得餾分的純度信息，進(jìn)一步完成后處理，實(shí)現(xiàn)樣品的微量制備。

3.2.2難分離組分的精細(xì)拆分功能通過接口連接兩套不同的色譜系統(tǒng)，通過LC-B系統(tǒng)對(duì)樣品進(jìn)行第一級(jí)分離; 根據(jù)分離的結(jié)果，選擇性地將難分離組分收集; 進(jìn)一步采用LC-A系統(tǒng)進(jìn)行第二級(jí)分離，根據(jù)樣品濃度選擇直接在線進(jìn)樣或者離線處理后再進(jìn)樣。通過兩級(jí)分離，可以完成對(duì)樣品的精細(xì)拆分。

3.2.3復(fù)雜樣品的二維分離功能對(duì)于復(fù)雜樣品，通過接口構(gòu)建二維色譜系統(tǒng)進(jìn)行高效分離。離線模式，通過LC-B系統(tǒng)進(jìn)行第一維分離，將樣品全部收集，并通過離線方式對(duì)餾分進(jìn)行合并、濃縮、除鹽等處理后，通過接口依次進(jìn)入到LC-A系統(tǒng)中進(jìn)行第二維分析。在線模式，通過接口同時(shí)連接一套常規(guī)分析系統(tǒng)(LC-B)和一套微量色譜系統(tǒng)(LC-A)，以圖1為例，當(dāng)閥A和閥B均處于虛線位置，利用LC-B完成第一維分析，餾分收集至托盤的樣品瓶中; 切換閥B到實(shí)線位置，利用三通閥C和活塞清洗管路和樣品針，避免交叉污染; 由于第二維是微量系統(tǒng)，樣品無需進(jìn)一步濃縮，切換閥A到實(shí)線位置，選擇需要的餾分，直接上樣到定量環(huán)中; 再次切換閥A到虛線位置，餾分進(jìn)入LC-A系統(tǒng)完成第二維分析; 此過程全程通過軟件實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化控制，無人為干擾。

3.3 接口的評(píng)價(jià)

3.3.1樣品的微量制備近年來，越來越多的稀有樣品通過分析型液相色譜完成微量制備，如生物樣品活性組分的提取[17]、中藥組分對(duì)照品的制備[18]。本研究中，利用一套液相色譜系統(tǒng)，連接新設(shè)計(jì)的接口，按照2.2.1節(jié)所述實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)4種芳香族化合物進(jìn)行了分離。圖2A是4種化合物的分離譜圖，各組分得到了基線分離。按照?qǐng)D上標(biāo)注虛線位置為起始點(diǎn)收集4組餾分，并離線進(jìn)行濃縮后，再依次進(jìn)樣到同一套色譜系統(tǒng)分析，疊加譜圖如圖2B所示，各餾分純度高且保留時(shí)間與目標(biāo)物一致。此實(shí)驗(yàn)說明，利用接口的進(jìn)樣-收集-再進(jìn)樣，按照預(yù)設(shè)域值在線收集對(duì)應(yīng)餾分，通過再次進(jìn)樣分析可以獲得餾分的純度信息，完成樣品的微量制備。

圖2 (A)分離4種芳香族化合物色譜圖; (B)4組餾分再進(jìn)樣疊加譜圖。 1. 苯乙酮; 2. 甲苯; 3. 乙苯; 4. 芴Fig.2 (A) Chromatogram of 4 kinds of aromatic compounds; (B) Stacked chromatogram of 4 fractions. 1. Acetophenone; 2. Toluene; 3. Ethylbenzene; 4. Fluorene

3.3.2難分離組分的精細(xì)拆分利用新構(gòu)建的接口連接兩套液相色譜系統(tǒng)，按照2.2.2節(jié)所述步驟分離5種蛋白質(zhì)樣品，結(jié)果如圖3所示。BSA和CEA屬于酸性蛋白質(zhì)，由于采用了pH 5.37的流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，所以在SCX模式下，BSA和CEA幾乎沒有保留，在系統(tǒng)死時(shí)間出峰，其余3種蛋白質(zhì)樣品分離效果良好。直接按照保留時(shí)間，在控制軟件設(shè)定收集的時(shí)間窗口，將圖中峰“1+2”的餾分收集，切入第二維RP模式，BSA和CEA得到了基線分離。通過設(shè)計(jì)的接口，可以連接二維系統(tǒng)，并根據(jù)一維分離情況，選擇性的將部分餾分切入第二維，實(shí)現(xiàn)難分離組分的精細(xì)拆分。

圖3 5種蛋白質(zhì)樣品的分離譜圖1.牛血清白蛋白; 2. 雞卵清白蛋白; 3. 核糖核酸酶B; 4. 核糖核酸酶A; 5. 細(xì)胞色素CFig.3 Chromatogram of 5 kinds of proteins1. Bovine serum albumin (BSA); 2. Chicken egg white albumin (CEA); 3. RNase B; 4. RNase A; 5. Cytochrome C

3.3.3復(fù)雜樣品的二維分離BSA酶解產(chǎn)同時(shí)具有疏水、親水等成分。采用設(shè)計(jì)的接口連接兩套液相色譜系統(tǒng)，第一維采用SCX模式，充分發(fā)揮上樣量高的優(yōu)勢(shì); 為了減少離線濃縮的二次處理步驟，第二維直接采用微柱RP模式，通過設(shè)定序列表全自動(dòng)在線分離。如圖4A所示，采用SCX模式，樣品響應(yīng)可分為兩個(gè)區(qū)域，區(qū)域Ⅰ(5～20 min)，組分響應(yīng)少且不高，按照出峰分2個(gè)餾分進(jìn)入第二維; 區(qū)域Ⅱ(24～36 min)有集中的、較強(qiáng)響應(yīng)，后續(xù)按每0.5 min一個(gè)餾分連續(xù)收集并全部依次進(jìn)入第二維分析。由于第一維SCX模式采用了高鹽的流動(dòng)相，第二維RP模式前10 min設(shè)置了較低比例有機(jī)相(2% 乙腈)的洗脫，一方面起到在線除鹽的作用，另一方面可以更好兼容兩維的流動(dòng)相。二維分析結(jié)果如圖4B所示，樣品得到了較好的分離效果，以1 mAU為積分閾值，共識(shí)別色譜峰292個(gè)。此外，整個(gè)二維分析用時(shí)約45 h，基于設(shè)計(jì)的接口，配合色譜數(shù)據(jù)工作站，全過程實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化分析，消除了人為操作帶來的誤差。

圖4 (A)BSA酶解產(chǎn)物SCX分離譜圖; (B)BSA酶解產(chǎn)物二維分離譜圖Fig.4 (A) SCX chromatogram of a tryptic digest of BSA; (B) 2D-LC chromatogram of a tryptic digest of BSA

4 結(jié) 論

以雙回路技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)了一種二維色譜在線/離線接口。采用4種芳香族化合物、5種蛋白質(zhì)樣品和BSA酶解產(chǎn)物對(duì)設(shè)計(jì)的接口進(jìn)行了系統(tǒng)地評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，通過接口連接不同色譜系統(tǒng)，不僅可以實(shí)現(xiàn)基本的自動(dòng)進(jìn)樣和餾分收集功能，還可利用色譜數(shù)據(jù)工作站設(shè)定程序?qū)崿F(xiàn)樣品的微量制備、難分離組分的精細(xì)拆分和復(fù)雜樣品的二維分離。該接口功能強(qiáng)大、自動(dòng)化程度高，為二維液相色譜的集成化控制及復(fù)雜樣品的分析提供了有力工具。

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