陳哲 黃靜 趙佳 郝耀山 梁宏

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，太原 030031）

草莓是全世界范圍內(nèi)種植的最重要的水果作物之一。近年來，我國的草莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展十分迅速，隨之而來的就是草莓病害，尤其是連續(xù)種植所帶來的土傳病害，對草莓產(chǎn)量影響大，嚴(yán)重時幾乎絕產(chǎn)［1］。草莓根腐病是一類土傳根部病害的統(tǒng)稱，可以導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。從草莓根腐病的患病根部可以分離出多達(dá)20個屬的真菌，包括鐮刀菌屬（Fusariumsp.）、 炭 疽 菌 屬（Colletotrichumsp.）、 絲 核 菌 屬（Rhizoctoniasp.）、疫霉菌屬（Phytophthorasp.）和擬盤多毛孢菌屬（Pestalotiopsissp.）等［2-3］。由于病原菌多種多樣，防治根腐病就是一個難以解決問題，至今沒有強(qiáng)有效的方法手段。傳統(tǒng)的土壤輪作方法已被證明能有效的控制許多土傳疾病，但這種方法很難適應(yīng)集約化種植系統(tǒng)；而化學(xué)試劑熏蒸的方法出于人類健康及環(huán)境的考慮，也逐漸被取代。因此，以微生物制劑為主的生物防治方法將會成為預(yù)防草莓根腐病的一種常見手段［4-5］。

目前報(bào)道過的根腐病生防菌包括芽孢桿菌（Bacillus）［6］、 木 霉 菌（Trichoderma）［7］、 鏈 霉 菌（Streptomyces）［8］等，梁銀等［9］研究發(fā)現(xiàn)利用生防菌與有機(jī)肥復(fù)配制成生物有機(jī)肥，既可以提高土壤肥力，又可以調(diào)節(jié)土壤微生物區(qū)系，減少病原菌數(shù)量。越來越多的人將目光聚焦到生防菌的開發(fā)利用，具有拮抗功能的菌種資源越豐富，挑選出優(yōu)良菌株的幾率也就越大，而且隨著研究的發(fā)展，人們更愿意篩選具有多種作用的功能性菌株去制備菌劑，例如同時具備抗病和促生兩種作用的菌株［10］。

本文針對當(dāng)?shù)販厥页Ｒ姷牟葺?，從發(fā)病草莓根部中分離出兩株病原菌-尖孢鐮刀菌，并研究前期篩選到的解淀粉芽孢桿菌CM3［11-12］對此病原菌的抑制作用，同時通過盆栽實(shí)驗(yàn)探索菌株CM3對根腐病的防治效果，旨在為草莓根腐病的防治提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 供試拮抗菌CM3由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心微生物課題組自行鑒定并保存。供試病原真菌炭疽病菌、灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、西葫蘆枯萎病菌、西葫蘆根腐病菌由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心微生物課題組保存。1.1.2 培 養(yǎng) 基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15-20 g，自來水 1 000 mL，自然pH。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離鑒定

1.2.1.1 病原菌的分離 將發(fā)病草莓植株的根部洗凈，瀝干水分備用。在超凈臺內(nèi)選取帶有病健交界處的根部，在病變組織處用手術(shù)刀切取長度約為5 mm 的根段，用 75%的酒精浸 30 s，再用 0.1%升汞水溶液處理 3-5 min，而后用無菌水沖洗 3 次，置于PDA培養(yǎng)基中，28℃條件下培養(yǎng) 3-4 d；菌落直徑約為 1 cm 時，在無菌的條件下用消毒的接種鉤挑取菌落邊緣的菌絲體，再次接到 PDA 培養(yǎng)基中央，進(jìn)行多次的分離純化，直至菌落生長整齊一致沒有雜菌出現(xiàn)。

1.2.1.2 病原菌的鑒定 形態(tài)鑒定：將分離菌株接種在PDA平板上 25℃ 下培養(yǎng)，觀察氣生菌絲生長狀況、菌落顏色和質(zhì)地，是否產(chǎn)生孢子和菌核等培養(yǎng)性狀。分子生物學(xué)鑒定：將分離純化到的菌株進(jìn) 行 18S rDNA、EF-1α（Translation elongation factor 1 alpha）、IGS（Nuclear ribosomal intergenic spacer region）和 mtSSU（Mitochondrial small subunit）基因序列測序，其中18S rDNA鑒定是真菌鑒定中常用的方法，后三者則都是鐮刀菌分類鑒定中常用基因手段［13-14］。測序后獲得的DNA序列在 NCBI 網(wǎng)站用Blast 進(jìn)行序列比對分析，最后使用軟件 MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 解淀粉芽孢桿菌CM3對尖刀鐮孢菌的抑制作用研究

1.2.2.1 解淀粉芽孢桿菌CM3的抑菌譜測定 采用平板對峙法，在 PDA 平板中心接種直徑為 8 mm的病原菌（包括分離的根腐病病菌FC2016-3和FC2016-7、草莓炭疽病菌、草莓灰霉病菌、西瓜枯萎病菌、西葫蘆枯萎病菌和西葫蘆根腐病菌），在距菌塊 3 cm 處接種菌株CM3，對照為只接種病原菌的平板，28℃ 培養(yǎng) 3-5 d，重復(fù)3次，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。1.2.2.2 解淀粉芽孢桿菌CM3對尖刀鐮孢菌的預(yù)防效果 選擇草莓進(jìn)行盆栽防治實(shí)驗(yàn)。盆栽實(shí)驗(yàn)使用無菌土，將蛭石和土以 1∶1 比例（w∶w）混合，160℃ 干熱滅菌5 h。選取生長一致的草莓匍匐莖幼苗，移栽于處理好的營養(yǎng)缽（10 cm×10 cm）中，緩苗 15 d 后，對幼苗進(jìn)行刀片傷根處理（同時設(shè)置無傷處理），然后開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)［15］。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置4個處理組，處理組1：接種拮抗菌CM3（濃度為1×108CFU/mL），48 h后接種病原菌孢子懸液（濃度為1×106CFU/mL）。處理組2：接種病原菌孢子懸液（濃度為1×106CFU/mL），48 h后接種拮抗菌CM3（濃度為1×108CFU/mL）。處理組3：只接種病原菌孢子懸液（濃度為1×106個/mL）。處理組4：只接種拮抗菌CM3（濃度為1×108CFU/mL）。處理組5：同樣量的無菌水。每組10株草莓苗，重復(fù)3次。

移栽后對每種作物進(jìn)行正常的栽培管理，10 d后開始進(jìn)行病害觀察，30 d后進(jìn)行病害調(diào)查以及指標(biāo)檢測。檢測指標(biāo)包括病情指數(shù)和防治效果，還有植株的株高、葉片面積、葉柄長和鮮重，其中葉片面積和葉柄長度統(tǒng)計(jì)選擇草莓心葉外第三片葉子。

草莓根腐病發(fā)病程度參考Vestberg等［16］的方法，分為6級：0級為根系未發(fā)??；1級為根系發(fā)病率≤30%，葉片正常；2級為30%＜ 根系發(fā)病率 ≤60%，葉片正常；3級為60%＜ 根系發(fā)病率≤80%，葉片變黃；4級為根系發(fā)病率 80%以上，葉片枯萎；5級為整株死亡，葉片干枯。

病情指數(shù)計(jì)算公式為：

病情指數(shù)（DSI）=100×∑（病害的級別 × 該級別的植株數(shù)）/（總株數(shù) × 病害的最高級別）

防治效果 = 100% ×（對照發(fā)病指數(shù)-處理發(fā)病指數(shù)）/對照發(fā)病指數(shù)

2 結(jié)果

2.1 草莓根腐病的病原菌分離與鑒定

2.1.1 病原菌分離及形態(tài)鑒定 在發(fā)病草莓的根部（圖1）分離純化到了2株病原菌，將其命名為FC2016-3和 FC2016-7。菌株FC2016-3 在 28℃ 的PDA 培養(yǎng)基上，菌落為白色，平均日生長量為12 mm，氣生菌細(xì)絲絨毛狀，為白色，培養(yǎng)基不變色（圖2-A、B）。菌株FC2016-7，菌落為白色，中心處漸漸變?yōu)樽仙?，平均日生長量為11 mm，氣生菌絲絮狀茂密，培養(yǎng)基背面會變深紫色（圖2-C、D）。

圖1 發(fā)病草莓根部橫切圖

2.1.2 病原菌分子鑒定 菌株FC2016-3和FC2016-7的 18S rDNA、EF-1α、IGS和 mtSSU 基因序列在GenBank 數(shù)據(jù)庫GenBank 中分別進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，兩個菌株與尖孢鐮刀菌的基因序列同源性都達(dá) 99%以上，說明分離到的菌株FC2016-3和FC2016-7均為尖孢鐮刀菌。每個基因序列分別構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3-圖6）。

圖2 菌株FC2016-3和FC2016-7在PDA培養(yǎng)基上生長狀態(tài)

2.2 解淀粉芽孢桿菌CM3對根腐病病原菌的抑制作用

菌株CM3對于根腐病病原菌的抑菌效果見圖7，明顯看出CM3對多種常見的土傳病害均有良好的效果，尤其是對草莓和瓜類的病害。同時，針對灰霉病這種既可以通過土壤傳播又可以通過水、空氣等途徑傳播的病害，菌株CM3同樣有抑制作用。說明菌株CM3不僅能防治土壤中的病害，還能制備成噴施微生物制劑進(jìn)行病害防治。

2.3 解淀粉芽孢桿菌CM3對根腐病的防治效果

根據(jù)分離病原菌的出現(xiàn)頻率及生長狀態(tài)，選擇病原菌FC2016-7進(jìn)行盆栽防治實(shí)驗(yàn)，在接種7 d后草莓葉片邊緣開始變色，15 d地上莖部開始變色，逐漸干枯，30 d后地上植株完全干枯。此時將草莓根部小心撥出，洗去附著在根系的泥土，發(fā)現(xiàn)有70%的根系完全變黑，剩余沒有完全變黑的根上存在黑褐色的病斑；切開根莖部發(fā)現(xiàn)其內(nèi)部變色明顯（圖8），與健康根部比較幾乎全部變色，有1/3的部分已經(jīng)變成了深紅褐色，病情與在大田中發(fā)現(xiàn)的病株一致。對此病根進(jìn)行分離，仍可分離出病原菌FC2016-7。

圖3 根據(jù)2株病原菌18S rDNA基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖4 根據(jù)2株病原菌EF-1α基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖5 根據(jù)2株病原菌IGS基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

從表1中看出，尖孢鐮刀菌FC2016-7對于草莓的致病性較強(qiáng)，處理組3的病情指數(shù)達(dá)到了58.57%，各項(xiàng)指標(biāo)均顯著低于對照水平。先接種病原菌后接種CM3的處理組1的病情指數(shù)為44.33%，防治效果達(dá)到了37.14%，但是植株生長狀態(tài)明顯受到了抑制，各項(xiàng)指標(biāo)均低于對照組，但是仍好于只接種病原菌的處理組3；而先接種CM3后接種病原菌的處理組2，病情指數(shù)則降低到了26.09%，防治效果可以達(dá)到64.86%，草莓的生長狀態(tài)要優(yōu)于處理1，幾乎和對照組持平。說明只要預(yù)先用菌株CM3對栽培基質(zhì)進(jìn)行處理，就能夠達(dá)到預(yù)防病原菌FC2016-7的效果，否則會影響其防治效果。

圖6 根據(jù)2株病原菌mtSSU基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖7 拮抗菌CM3對多種病原菌的抑制效果

圖8 盆栽實(shí)驗(yàn)草莓根部圖

從促進(jìn)生長的角度來看，只用菌株CM3處理的處理組4可以促進(jìn)草莓生長。株高、根部鮮重和地上鮮重比對照組有顯著提高，分別提高了17.51%、16.08%、9.06%；葉柄長度和葉面積的增加則不顯著。說明解淀粉芽孢桿菌CM3不僅有防治病原菌的能力，還有一定的促生長能力，十分適合作為微生物制劑進(jìn)行開發(fā)利用。

表1 解淀粉芽孢桿菌CM3對尖刀鐮孢菌FC2016-7的防治效果及生長影響

3 討論

研究植物病害首先就要進(jìn)行病原菌的分離鑒定，使用分子技術(shù)對病原菌進(jìn)行鑒定已經(jīng)成為一種常用、快速、靈敏且準(zhǔn)確可靠的手段［17-18］。本研究根據(jù)2個菌株的18S rDNA、EF-1α、IGS和mtSSU 4個基因序列的分析結(jié)果，再結(jié)合病原菌的形態(tài)特征，將分離到的菌株 FC2016-3和FC2016-7 確定為尖孢鐮刀菌，結(jié)果準(zhǔn)確可信。盆栽實(shí)驗(yàn)顯示，菌株FC2016-7的致病性較強(qiáng)，發(fā)病率能夠達(dá)到80%，病情指數(shù)也高達(dá)58.57%。張陽等［19］從草莓根腐病株中分離到41個菌株，通過形態(tài)學(xué)、分子生物學(xué)手段對菌株的分類地位進(jìn)行了鑒定發(fā)現(xiàn)，尖孢鐮刀菌占菌株總量的9.75%，并且其致病力較強(qiáng)，可達(dá)90%。比較蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)［20］，不同毒力的尖孢鐮刀菌株的蛋白質(zhì)組是有顯著性差異的，部分蛋白僅僅存在于高毒力菌株中，還有一些蛋白質(zhì)在高毒力菌株中的含量較高，這些蛋白質(zhì)主要與菌株的代謝、抗氧化、電子傳遞、細(xì)胞周期和轉(zhuǎn)錄活動有關(guān)。

解淀粉芽孢桿菌CM3本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中篩選到的一株有抑菌效果的菌株，可以有效的預(yù)防草莓灰霉病和番茄灰霉病的發(fā)生，抑菌成分有穩(wěn)定的性能及較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)性。本研究發(fā)現(xiàn)菌株CM3同樣可以抑制土傳病害的病原菌，如根腐病、枯萎病和炭疽病；盆栽實(shí)驗(yàn)也顯示其能夠有效的防治尖孢鐮刀菌引起的根腐病的發(fā)生，防治效果達(dá)到了64.86%，而且越早加入，防治的效果會越好；同時也發(fā)現(xiàn)菌株CM3可以促進(jìn)草莓植株的生長發(fā)育，株高、根鮮重以及地上鮮重分別提高了17.51%、16.08%、9.06%。Shen等［4］證實(shí)吸水鏈霉菌BOF-B04可以顯著增加草莓植物的鮮重并且降低根腐病的發(fā)生率，盆栽防治效果達(dá)到了63.35%；同時菌株也改變了微生物根際土壤的群落結(jié)構(gòu)，土壤中的真菌數(shù)量顯著減少，比對照組降低了82.43%。

在整個植物發(fā)育階段，由于土壤環(huán)境的復(fù)雜性，只具有單一功能的微生物已經(jīng)無法滿足實(shí)際生產(chǎn)的需求，所以許多學(xué)者開始關(guān)注具有多種功能的有益微生物。這類微生物會產(chǎn)生抗生素，通過與病原菌競爭營養(yǎng)物質(zhì)或誘導(dǎo)宿主植物的系統(tǒng)性抗性來抵抗病原菌；還可能生產(chǎn)植物激素，通過促進(jìn)植物根部對養(yǎng)分的吸收而達(dá)到促進(jìn)植物生長的能力［21］。Mukta等［22］發(fā)現(xiàn)兩株植物益生菌鏈霉菌StenotrophomonasBph-4和蒼白桿菌OchrobacterumBTLK6a均可以顯著增加草莓果實(shí)產(chǎn)量，與對照組相比分別增加了56%和43%，進(jìn)一步研究揭示了它們不僅可以分泌生長激素吲哚乙酸，同時也能分析抗生素抑制致病微生物的生長。梁曉琳等［23］將Bacillus amyloliquefaciensSQR9制成了復(fù)合微生物肥料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，復(fù)合微生物肥料集化肥速效、有機(jī)肥長效和生物肥增效等優(yōu)勢為一體，能明顯促進(jìn)番茄的生長，在總養(yǎng)分 100 g/kg和140 g/kg 施肥水平下，番茄增產(chǎn)幅度分別達(dá) 37.73% 和 44.77%。

本實(shí)驗(yàn)中解淀粉芽孢桿菌 CM3不僅可以防治草莓根腐病的發(fā)生，也促進(jìn)了草莓植株的生長，綜合前期研究積累，可以說菌株CM3是一株多功能微生物菌株，滿足了開發(fā)微生物制劑的條件，可以將其應(yīng)用于草莓土傳病害的生物防治中。若能將其開發(fā)成新型微生物復(fù)合肥料，不僅可以提供作物生長所需的全面營養(yǎng)，促進(jìn)植物生長，提高其抗逆性，免受病原菌的侵害，還能改善土壤結(jié)構(gòu)，增加肥力，改善農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)，提高產(chǎn)量。同時，能達(dá)到減少化肥用量，保護(hù)生態(tài)環(huán)境的效果。

4 結(jié)論

本研究從草莓根腐病根部分離到了2株病原菌，根據(jù) 18S rDNA、EF-1α、IGS和 mtSSU 4個基因序列的分析結(jié)果和菌株形態(tài)特征，將這兩株菌株鑒定為尖孢鐮刀菌，分別命名為FC2016-3和FC2016-7。解淀粉芽孢桿菌CM3對菌株FC2016-3和FC2016-3在內(nèi)的多株土傳病害病原菌有明顯的抑制作用。盆栽實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，菌株CM3對尖孢鐮刀菌FC2016-7引起的草莓根腐病有良好的生物防治效果，防治效果分別為64.86%，同時也發(fā)現(xiàn)菌株CM3可以促進(jìn)草莓植株的生長發(fā)育，株高、根鮮重以及地上鮮重分別提高了17.51%、16.08%、9.06%。

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